2020年8月10日星期一
16
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
2020年8月10日星期一
17
（3）选择标记
18
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因：
d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
2020年8月10日星期一
7
五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
2020年8月10日星期一
2
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
2020年8月10日星期一
5
外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
2020年8月10日星期一
6
三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
11
实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活 因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人 DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时， 产生错折叠和非糖基化，而在酵母 中表达tPA产生过糖基化，二者的产 物都没有生物活性。
2020年8月10日星期一
12
分泌型哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外 源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达 单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽 链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中被切
除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质 网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖 基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也 使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。
2020年8月10日星期一
13
第二节外源基因在哺乳动物细胞中表达 一、哺乳动物细胞表达载体
（一）质粒型载体：通过对细菌质粒改造 获得。一般为在原质粒的基础上，插入了 一些病毒或其它一些物种及人的基因表达 调控序列。 1、哺乳动物细胞质粒表达载体的结构
猿猴病毒40早期基因 腺病毒主要晚期启动子 小鼠β－珠蛋白基因
强度
40～160 4 2 1.1 1 0.4
0.2
2020年8月10日星期一
15
（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所 有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结构， 多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化位点 上游11～30核苷酸的保守序列AAUAAA和一 个下游的GU或U富含区组成，
0~60% ＋/－
－ ＋/－ ＋/－ － － －
0~10%
＋/－ ＋ ＋ ＋/－ ＋ ＋ －
0～30%
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
0~1%
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
2020年8月10日星期一
4
二、真核细胞表达外源基因的意义
研究基因表达产物的功能 生产有生物活性的蛋白质
1、将目的基因导入各种细胞中，观察 表达产物对细胞活动的影响从而推论其 功能特征
2、表达出来的蛋白质不能有效、正 确的折叠及二硫键配对错误
3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸 化和羧化等翻译后修饰以及对原核 细胞有毒性。
2020年种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较
产率 蛋白酶消化
糖基化 分泌 折叠
磷酸化 酰基化 酰胺化
大肠杆菌 酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞
mRNA的鉴定：印迹杂交或反转录PCR
蛋白产物鉴定：免疫印迹或电泳
提取方法有：沉淀法、电泳法、层析法 等
2020年8月10日星期一
8
哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白 的理想表达系统，是目前应用最广泛的动 物细胞表达系统。其优点和缺点都极其显 著。产物的抗原性、免疫原性和功能与天 然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。 一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。
10
哺乳动物细胞表达体系的优点
• 哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经 发展很快。
• 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不
能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后
加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分
泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物
细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的
蛋白质。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
9
但该表达系统的表达水平较低、培养基 昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在
实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞
表达系统通常用来生产用常规方法无法获 得的真核细胞蛋白。如EPO，TNF受体，
基因工程单抗等。
CHO（中国仓鼠卵巢）是目前重组糖蛋 白生产的首选体系。
2020年8月10日星期一
典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺
式作用元件：
2020年8月10日星期一
14
（1）启动子
常用的启动子种类及其各自的强度
启动子
来
源
EF －1 CMV
RSV SV40 later
SV40 early Adeno major late β－globin
人延长因子1基因 人巨细胞病毒立早基因
劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因