离子交换法是根据分子电荷密度来分离纯化免 疫球蛋白的。杨德等利用 DEAE 葡聚糖凝胶 A- 50 离子交换色谱纯化 Ig，Tis- HC1 缓 冲 液 （含 0.15 mol/L 的 NaC） l 洗脱，再经 Sephadex G200 凝胶过 滤，得到的 Ig 纯度达 99％[5]。
离子交换层析是一种成熟的技术，它的重现性 好，简单易行，具有分辨率高、容量大、收获率高 等优点，而且具有浓缩效应，通常作为多步层析中 的第一步。不同的抗体具有不同的等电点，即使是 同一亚类的免疫球蛋白也会有相当大的差异，因此 并没有一个通用的程序进行离子交换层析。 3.2 凝胶过滤法
常用聚乙二醇 （PEG） 沉淀，PEG 是非离子型 水溶性聚合物，高浓度也不会引起蛋白质变性，且 沉淀时间比硫酸铵和乙醇都短，不影响离心处理。 该法最早由 Polson 提出，先用 3.5％的 PEG8000 沉 淀脂类，再使用 12％的 PEG 沉淀上清中的 Ig。改 进后的方法是使用氯仿去脂，用 12％的 PEG6000 进 行 沉 淀 ， 该 法 比 单 独 使 用 PEG 的 产 量 提 高 了 2.75 倍。Deignan 等使用冻融法、PEG 法、硫酸葡聚 糖法 （DS）、MgCl2 法、冷异丙酮和丙酮法去脂获得 WSF 后，分别比较了 用 Na2SO4 盐 析 、 1/3 饱 和 度 (NH4)2SO4 等电点盐析和 12％的 PEG 沉淀提取 Ig 的效
嗜硫色谱又称亲硫色谱法，Porath 于 1985 年 报道了将其用于免疫球蛋白的纯化，其交换介质是 琼脂糖在二乙烯砜 （DVS） 和 2 - 巯基乙醇或 3 巯基丙二醇作用下形成的活化的砜 - 硫醚基团。此 基团能在硫酸盐和磷酸盐存在下吸附免疫球蛋白表 面的适当位点，对不同的亚类没有选择性。基团在 高盐环境下选择性地结合免疫球蛋白，但形成的是 亲 水 性 基 团 ， 所 以 不 同 于 疏 水 作 用 色 谱 。 Hansen 等比较了改进型胶 （St- ge） l 与原 Porath 制备的嗜 硫色谱材料 pT- gel 对 Ig 的纯化效果，两者纯度均 可 达 98％ 以 上 ， 但 sT- gel 的 回 收 率 大 大 高 于 T- gel。嗜硫色谱吸附能力可达 25 mg Ig/mL 胶，Ig 的回收率近 99％。傅蓉等[7]对 Ig 的嗜硫色谱纯化进 行的研究也表明可获得电泳纯 Ig，活性回收率达 70％以上。 3.4 亲和色谱法
多种方法联合使用可得到较纯的 Ig，Almeida 采用硫酸钠和辛酸联合沉淀法提取抗巨窍腹蛇毒 Ig，Lemamy 采用 PEG8000 和硫酸铵联合沉淀最终 得到纯度达 95％的 Ig，也有人使用硫酸铵和乙醇 联合沉淀提取 Ig，均获得了成功[4]。
3 免疫球蛋白的纯化精制
经提取得到的 Ig 粗品无法达到注射或免疫检 测的要求，必须进一步纯化。蛋白质提纯多采用色 谱技术，Ig 的提纯也基于这一方法，并加以改进。 3.1 离子交换色谱法
行组合使用，可以收到良好的制取效果。
关键词：牛初乳；免疫球蛋白；提取和纯化
中图分类号：TS252
文献标志码：A
免疫球蛋白 （Immunoglobulin，Ig） 是一 类 具 有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，普遍 存在于动物的血液、组织液及外分泌液中，其中血 清和初乳中的含量最高。免疫球蛋白的分子量很 大，通常由 1 000 个以上的氨基酸连接而成，其基 本结构都是由两条相同的重链 （H 链） 和两条相同 的轻链 （L 链） 构成的对称性结构，呈“Y”字型 排列。Ig 在动物的免疫和生理调节过程中起着重要 作用，是动物体内的免疫系统最为关键的物质之 一。大量的研究表明，Ig 对许多病原微生物和毒素 有抑制作用，其生物学功能主要表现为与相应抗原 特异性结合、激活补体、结合细胞产生多种生物学 表达、通过胎盘传递免疫力等[1]。
超滤法易于工业化，因此不少学者寻求使用超 滤进行 Ig 的分离。超滤多使用多孔纤维超滤膜进 行，也可在多次沉淀或亲和层析后使用，以进一步 纯化 Ig。Kim 和 Nakai 使用 Amicon UF 系统在 NaCl 存 在 下 直 接 从 WSF 中 分 离 Ig （Ig 在 NaCl 达 1.5 mol/L 时即可形成二聚体)，发现效果较好。
相比而言，用乳脂分离机去脂不添加化学试 剂，不损坏 Ig 活性，安全性好，不影响脂类的进
* 为通讯作者
一步利用，是目前去脂研究中的最佳方法。
2 免疫球蛋白的分离提取
将 WSF 中 Ig 分离出来即可得 Ig 粗品，常用 的方法为无机物沉淀法，即盐析法，此外还可采 用有机物沉淀法、有机溶剂沉淀、萃取法或将这 几种方法联合使用。 2.1 无机物沉淀法
试验研究
S h iyan Yan jiu
栏目主持人：刘润平
牛初乳免疫球蛋白的提取与纯化方法研究
徐 钦，* 刘成国
（湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410128）
摘要： 牛初乳中的免疫球蛋白是动物体内免疫系统最为关键的物质之一，有抑制毒素和病原微生物等功能。国
内外在提取活性免疫球蛋白的方法上均有大量的研究，依据不同用途选择抗体的提取纯化方法，并将不同方法进
目前主要是对牛初乳中的免疫球蛋白进行利用， 牛初乳中的 Ig 含量大约为 30 mg/mL~50 mg/mL。我 国牛初乳资源丰富，是一个巨大的资源宝库[2]。本文 旨在对牛初乳中免疫球蛋白的提取、纯化方法进行 综述，以期更好地开发利用食品新资源。
1 水溶性组分 （WS F） 的分离
牛初乳中含有一定的脂类，多以脂蛋白的形式 存在，而 Ig 为水溶性蛋白，Ig 的分离首先是去脂 获得 WSF。目前去脂的方法包括乳脂分离机分离 法，水稀释法，聚乙二醇 （PEG） 6000 沉淀法，硫 酸葡聚糖 （DS） 沉淀法，天然树胶沉淀法，氯仿、 苯酚、辛酸等有机溶剂抽提沉淀法，超滤、超临界 萃取法与冻融等物理化学方法[3]。
将疏水的烃基连接到亲水多孔的凝胶上，在高
农产品加工 73 2010·1
试验研究
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盐浓度下，蛋白质分子中暴露的疏水基团和凝胶上 的烃基相互作用吸附在柱上，这种方法非常适合于
栏目主持人：刘润平
究。依据不同的用途选择抗体的提取纯化方法，并 将不同方法进行组合使用，可以收到良好的效果。
[4] Nakai Brodin T， Reis K， Bjorck L. A powerful tool for
比较以上提取纯化方法可知，超滤法虽然所得 纯度不高，但操作简单，与水稀释法连用可不加任 何化学试剂而用于食品级 Ig 的分离；色谱的纯化 效率虽高，但抗体损失较大，多种色谱联合使用可 以达到较高纯度，但往往得率低，操作费时；嗜硫 色谱在 Ig 的纯化中显示出选择性强、活性回收率 高、易于工业化放大的优点，已成功用于重组单链 抗 体 片 段 与 Fab 段 的 分 离 ； 生 物 工 程 构 建 配 体 TG19318 亲和色谱的应用简化了免疫球蛋白的分 离，但其制备和使用成本相对较高，对 Ig 的非特
Hale Waihona Puke 72 农产品加工 2010·1
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果，结果显示12％的 PEG 沉淀法的得率较高。 2.3 有机溶剂沉淀法
由冰乙醇分级沉淀。由于乙醇可以食用，因此 该法比较安全，但是能耗较高，成本大。水稀释后 向 WSF 加入预冷冰乙醇至终质量分数为 60％，4 ℃静置，沉淀离心，用 30 mmol/L 的 NaCl 溶解沉 淀，过滤除脂蛋白，然后再用终质量分数分别为 30%和 25％的冷乙醇离心沉淀，得纯度达 99％以 上的 Ig。 2.4 超滤法
盐析法是利用不同的蛋白对盐浓度敏感程度的 差异性进行的。该法是蛋白质提取的经典方法，最 常用的是硫酸铵或硫酸钠沉淀法，在高盐环境中 Ig 能被沉淀下来。Jensenius 在使用硫酸葡聚糖和冻融 法去脂后，以 20％的 Na2SO4 盐析，Ig 回收率分别达 70％~80％和 50％~70％，若需进一步去除杂质则可 用 14％的 Na2SO4 再进行盐析，Ig 几乎没有损失。此 外，可使用氯化镁等无机物和磷钨酸共同作用，产 生沉淀提取 Ig。 2.2 高分子有机聚合物沉淀法
凝胶过滤法是基于免疫球蛋白相对分子量大于 其他蛋白质来分离的。对 Ig 类的抗体来说，凝胶过滤 常用来去除电荷性与单克隆抗体相同的杂质，如转 铁蛋白等。不同凝胶介质的分离范围是不同的，应
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S h iyan Yan jiu 选择分离抗体分子大小范围内的相应凝胶介质。另 外，粗颗粒的凝胶介质速度快，细颗粒的凝胶介质 分辨率高。当用同样直径的层析柱分离 2 种以上的 物质时，长层析柱比短的分辨率高；当用同样长度 的层析柱分离 2 种以上的物质时，长层析柱比短的 分辨率高，层析柱直径大的比小的分辨率高[6]。 3.3 嗜硫色谱法
异性一步色谱纯化可用嗜硫色谱法；应用于免疫检 测的抗体，宜用抗原偶联的色谱柱纯化获得特异性 Ig；金属离子色谱法可用于 Ig 亚群的分析分离研
的测定[J]. 中国草食动物，2004，24 （6）：13. [9] 张鹏举，邱永敏，张永立，等. 用疏水作用色谱法纯
binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies [J]. Immunol，1985，35：2 589- 2 593. [5] 杨德，王道若. 用离子交换层析法纯化鸡蛋黄 IgG[J]. 华西医科大学报，1991，22 （1）：17- 20. [6] 马玉平，姜瞻梅，宋淑珍. 牛初乳中免疫球蛋白 IgG 的检测[J]. 黑龙江畜牧兽医，2002 （4）：25- 26. [7] 傅蓉，李珑，王中来，等. 鸡卵黄免疫球蛋白的嗜硫 色谱一步分离纯化[J]. 福州大学学报，2000，28 （6）： 111- 114. [8] 刘艳芬，邹淑当，黄保，等. 牛初乳免疫球蛋白（IgG）
盐析后的卵黄抗体的进一步分离纯化，免除了脱盐 过程。Hassl 等用最终质量分数为 4.4％的 PEG 除 去了卵黄脂类，获得的上清经苯基琼脂糖凝胶 CL- 4B 疏水作用色谱联合 Sephacryl S- 300 凝胶过 滤，最终获得的 Ig 纯度高于 85％，该法得到的 Ig 无抗体片段不聚集、不损坏抗体完整性。但由于 Ig 各亚群的疏水性不同，因此得率较低[9]。