9.除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外， 可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放 孵箱15分钟溶解结晶。 10.至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值， 就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选 用TMB显色液则用450）；而对于SDS和酸化异丙醇， 则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。
现代应用 实验原理
实验步骤
注意事项
细胞筛 选培养
药物药 效实验
现代 应用
药物毒 性检测
基因工 程


实验原理：
1. MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基 四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。 2.检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外 源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 （DMSO）能溶解细胞中的甲臜结晶 ，用酶联免疫 检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映 活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成 的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物 活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 淋巴细胞体外转化代表着细胞免疫功能，因此测定 淋巴细胞体外增殖反应是研究细胞免疫功能的重要 手段和指标。




5. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来， 导 致每孔中的细胞数量不等，吹打次数100左右，就可以 吹打均匀了。 6. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹 下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。 7. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现 细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆， 一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分 散会产生接触抑制，影响细胞的生长。 8. 96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于 具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致 培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同， 为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种 细胞，而不作为指标检测孔。


1. 接种细胞：用含10％胎小牛血清得1640培养液配成 单个细胞悬液，接种到96孔板，每孔体积 100~200ul. 2. 培养细胞：5%CO2，37℃孵育，培养24-72h（可根 据试验目的和要求决定培养时间）。 3. 呈色：培养24-72h后，每孔加MTT溶液（5mg/ml， 用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h， 终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心 后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO， 脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。 4. 比色：选择490nm（570nm）波长，在酶联免疫监测 仪上测定各孔光吸收值，记录结果.


影响主要因素：
影响淋巴细胞增殖反应的因素很多，主要是淋巴细胞 浓度、培养时间、分裂原浓度。 淋巴细胞浓度：103~107 培养时间：24h~72h 抗原刺激物浓度:5~25ul 淋巴细胞分裂原： 检测T淋巴细胞增殖：刀豆蛋白A(ConA)或植物血凝素 （PHA） 检测B淋巴细胞增殖: 脂多糖(LPS)


测细胞相对数和相对活力，但不 能测定细胞绝对数。 2. MTT一般最好现用现配，一般称取MTT0.5g，溶于 100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中， 配制成5mg/ml，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的 细菌，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小 剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免 分解。MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 3. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种 透明的簿膜手套。 4. 做MTT时，尽量无菌操作，因为MTT对菌很敏感， 细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。