红曲酯化酶促反应及其代谢产物特征

陈帅;郑佳;刘琨毅;彭昱雯;黄钧;易彬;赵金松;周荣清

【摘 要】The research on kinetics and metabolism of esterification

catalyzed by Monascus esterifying enzymes were carried out with hexanoie

acid and ethanol as substrates. The results showed that the consumption

of hexanoie acid subsequently grew steadily after the initial stage from 0 -

8h in which it increased rapidly along with the reaction time,and then

reached a balance after 24 h. Inhibition was noted by excessive ethanol,

but relieved partially when concentration of hexanoic acid increased.

Among 15.81 -142.31 mmol/L of hexanoic acid concentration,single sub-

strate reaction was identified by positive linear relation between initial

velocity and concentration of hexanoie acid. The crude Monascus

esterifying preparation contained various enzymes so that the empirical

model could only be estab- lished according to experiment results, which

could better express the kinetics characteristic of the reaction catalyzed by

the crude enzyme. Ethyl hexanoate was the main product, followed by

ethyl caprylate,ethyl lionleate,ethyl oleate, ethyl palmitate and

phenylacetaldehyde. The results of OAV analysis indicated that

esterification catalyzed by crude Monascus esterifying preparation was

appropriate for improving the quality of Chinese liquor and other

products.%以己酸和乙醇为底物，研究了红曲霉粗酶催化反应的动力学规律及其影响条件。研究结果表明，己酸的消耗量在0～8h内迅速上升，随后则缓慢上升，反应24h后，趋于平衡。过量的乙醇对反应有抑制作用，但随着已酸浓度的提高被部分解除。当己酸浓度在15．81—142．31mmol／L，反应初速率与其浓度呈现良好的正相关性，可视为单底物反应。红曲霉粗酶含多种酶类，酶促酯化反应机理颇为复杂，其动力学关系受多种条件控制，依据试验结果建立的经验数学模型能较好地表征其粗酶酶促反应动力学特征，催化形成的主要产物为已酸乙酯，其次为辛酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯、棕榈酸乙酯和苯乙醛，其OVA分析的结果表明，该类酶促反应的产物适合白酒等产品风格的改善。

【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2012(038)002

【总页数】5页(P47-51)

【关键词】酶促酯化反应;动力学模型;复合酶;己酸乙酯

【作 者】陈帅;郑佳;刘琨毅;彭昱雯;黄钧;易彬;赵金松;周荣清

【作者单位】四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;国家固态酿造工程技术研究中心,四川泸州646000;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065／四川大学轻纺与食品学院,四川成都610065／国家固态酿造工程技术研究中心,四川泸州646000

【正文语种】中 文

【中图分类】TQ463.2 红曲霉属于真菌界、子囊菌门、真子囊菌纲、散子囊菌目、红曲菌科、红曲菌属［1］，因其在生长代谢过程中能产生各种生理活性物质，比如Monacolin K［2］、红曲色素［3］、酯化酶［4］等，已被广泛应用于食品、医药等众多领域［5］。以糙米为原料，接种红曲霉后发酵而制成的红曲作为增色增香剂已广泛应用于诸如香肠、酿酒、食醋等食品生产。迄今，国内外的研究主要集中在聚酮类次级代谢产物上，例如李雪梅等［6］阐述了红曲色素、Monacolins类化合物等代谢物的分离、化学结构及生物活性等方面的研究概况;Mukherjee等［3］分离纯化出一种新型的具有食用及医用价值的红曲色素;Hajjaj等［7］通过对红曲色素代谢动力学的研究认为其代谢受一种在厌氧环境下大量积累的未知化合物的抑制。红曲霉酯化酶在白酒酿造中具有重要的作用［8－9］，主要作为增香剂提高白酒中的主体呈香呈味物质进而改善白酒品质，但对作用机理及代谢产物形成特点的报道甚少，例如王牛牛等［10］通过响应面法优化得到了红曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的最佳催化条件;任道群等［11］对红曲霉的4种代谢产物进行了定量分析。

本论文描述了红曲粗酶催化的己酸和乙醇的酶促动力规律和反应条件的影响，并建立了相应的动力学模型，应用气-质联用(GC-MS)定量地检测了反应产物的形成特征，其研究结果对红曲酯化酶在白酒酿造过程中的应用具有理论指导意义。

1.1 材料与仪器

1.1.1 微生物菌株

红曲霉:AS 3.972，购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.1.2 主要试剂及仪器

正己酸、无水乙醇、NaOH、无水乙醚、无水Na2SO4(分析纯);定量标准品:2-辛醇、辛酸，购自Aladdin公司;糙米，购自本地农贸市场。

PHS-3C精密酸度仪，上海大浦仪器厂;78-1磁力搅拌器，江苏省金坛市医疗仪器厂;DHP-9162电热恒温培养箱，上海一恒医疗器械厂;Trace GC Ultra DSQⅡ气相质谱联用仪，美国Thermo Fisher公司。

1.2 培养基

1.2.1 麦芽汁培养基

麦芽糖度10°Brix，琼脂2%。

1.2.2 种子培养

500 mL三角瓶中装入25 g蒸至无白心的糙米，用10 mL 3%的醋酸液洗脱斜面培养基上的菌丝，接入1 mL菌悬液，于(32±0.2)℃培养。以上培养基均在121℃下灭菌20 min备用。

1.3 实验方法

1.3.1 红曲霉酯化酶的制备

式中:m为红曲质量，g;C1为NaOH浓度，mol/L;V2为NaOH消耗体积;C2为H2SO4浓度，mol/L;V2为H2SO4消耗体积，mL;V总为馏出液总体积，mL。

1.3.4 反应底物己酸的消耗动力学

取3个250 mL锥形瓶，分别加入5 g红曲粉(酯化力为42.38 mg/g)、1 mL正己酸和99 mL 10%、20%、40%乙醇溶液密封后，置于(32±0.2)℃，间隙取样测定其反应液中己酸的残留量。反应初速率测定:测定反应1 h、2 h、4 h时的己酸消耗速率，通过线性拟合建立动力学方程。

1.3.5 反应产物组分测定

参考文献［14］所述方法，取50 mL反应终了样品置于250 mL具塞圆底烧瓶中，加入50 mL无水乙醚及定量标准品(2-辛醇、辛酸)，调节pH值至10～12，反复振荡20 min，静置，经分液漏斗分液得到有机相，重复提取2次，合并有机相命名为extraction 1;将50 mL无水乙醚加入到水相中，调节pH值至1～2，反复振荡20 min，静置，经分液漏斗分液得到有机相，重复提取2次，合并有机相命名为extraction 2。向2种收集液中分别加入5 g无水NaSO4过夜，过滤，在冰浴中经氮气吹扫仪浓缩至0.5 mL。随后采用配备有 TR-5MS(30.0m ×320 μm

×0.25 μm)的 Trace GC Ultra DSQⅡ气相质谱联用仪定量检测其组分。操作条件:进样口温度:250℃;升温程序:40℃保持5 min，以5℃/min升温至200℃，保持5

min;质谱条件:离子源温度:250℃;电离方式:EI;电子强度:70 eV;扫描范围:35～400amu。

1.4 数据处理

利用Origin 7.5对红曲酶促酯化反应的动力学模型、影响条件以及代谢产物特征进行分析;利用SPSS 17.0对反应初速率r与己酸初始浓度c的关系曲线进行显著性分析。

2.1 反应底物己酸的消耗动力学

在过量乙醇存在的条件下，红曲霉酯化酶(酯化力为42.38 mg/g)催化的1%(V/V，下同)己酸的消耗动力学如图1所示。己酸浓度保持不变，乙醇浓度从10%增加到40%，96h内的变化趋势是类似的。在0～8h的初始阶段，随着反应时间的增加，反应中的己酸含量迅速降低。反应进行到8h时，己酸的含量从79.06 mmol/L分别降低到58.89、61.95、72.27 mmol/L。继续进行酶促反应，到24h时分别降至60.61、61.57、71.89 mmol/L。然而再增加反应时间，反应液中己酸浓度基本保持稳定，反应进行到96h，己酸的含量分别是57.17、59.85、72.08

mmol/L。试验结果表明，在乙醇过量的条件下，己酸主要是在0～8h的反应阶段被转换，且受乙醇浓度的影响较大。乙醇浓度越高，被消耗的己酸则越少。当乙醇浓度从10%增加到40%，乙醇和己酸的酯化反应可能从酶促转换为非酶促反应，高浓度的乙醇导致蛋白质变性是导致己酸消耗速率降低的主要因素，因为蛋白质变性致使酯化酶活力降低［15］。此外，乙醇在水溶液中的高溶解性质，过量的酰基受体与酶形成的可逆结合物难以转换为产物也是致使其酶促反应速率降低的原因