华中科技大学博士学位论文中文摘要脊髓NG2细胞在大鼠神经病理性疼痛中的作用及机制研究博士研究生王萍博士生导师田玉科教授华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室研究背景神经病理性疼痛(Neuropathic pain)是神经系统损伤引起的一种难以治疗的慢性状态，国际疼痛研究协会( IASP,1994)称之为“由于外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱引起的疼痛”。
感染、创伤、代谢性疾病、肿瘤化疗、手术、射线、神经毒性药物、神经受压缺血、炎症和肿瘤的侵袭都可引起神经病理性(中枢性和周围性) 疼痛。
急性疼痛对机体具有警示和“保护”作用，而神经病理性疼痛与之不同，它可以持续存在，对机体无益，甚至会严重影响生活质量。
神经病理性疼痛的产生机制十分复杂，从神经损伤（伤害性刺激）到疼痛产生，会在神经系统发生一系列的变化。
脊髓是疼痛信息传递和整合的初级中枢，脊髓背角汇聚着来自外周的不同传入神经与来自脑干和大脑皮质的下行投射神经，加上背角局部中间神经元，组成十分复杂的神经网络，并含有非常丰富的生物活性物质，因此，脊髓在神经病理性疼痛的发生发展中起到重要的作用。
传统观点认为神经元是中枢神经系统中重要的信号细胞，而胶质细胞仅仅是起绝缘、营养与支持作用，因此，以往在对疼痛的研究中大量的实验关注于神经元的功能。
但近年来发现，胶质细胞在疼痛的产生与发展过程中起重要的作用。
Colburn等首次提出小胶质细胞的活化出现在疼痛的起始阶段,而星型胶质细胞在疼痛的发展和持续阶段有很强的活化反应。
外周神经损伤后初级传入神经纤维中枢端释放P物质（substance P, SP）、兴奋性氨基酸（Excitatory amino acids,EAAs）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,华中科技大学博士学位论文ATP）等，作用于脊髓胶质细胞的受体，胶质细胞激活后产生和释放大量疼痛相关介质，如细胞因子、炎性介质和神经活性物质等。
过量的这些物质积聚又能敏化神经元和胶质细胞，最终造成疼痛信号的产生和扩大，使病理性疼痛进一步发展和持续。
近年来，在中枢神经系统发现了一类兼具神经元与胶质细胞特性的细胞，这类细胞表面特异性表达硫酸软骨素蛋白多糖NG2，被称为NG2细胞。
新近的研究认为它是继少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞后的又一类“新型”胶质细胞系，广泛分布于中枢神经系统的灰质与白质中。
在对NG2细胞的研究中发现，在多种神经系统损伤与疾病过程中可出现NG2细胞的活化，主要表现为胞体增大，突起增多，NG2分子表达增多。
在海马区NG2细胞与兴奋性神经元或抑制性神经元均可形成突触联系，NG2细胞膜表面的AMPA受体和GABA A受体参与了由神经元到NG2细胞的信息传导。
在神经系统疾病过程中NG2细胞可产生和释放多种神经兴奋性物质。
此外，研究发现脂多糖刺激小胶质细胞活化时可诱导小胶质细胞表达NG2分子及炎性介质，RNA干扰下调NG2分子的表达后，小胶质细胞活化表达的炎性介质下调。
上述研究提示NG2细胞在神经活动（包括疼痛的发生发展）中可能占据某种重要的地位，但由于对该细胞了解较晚，相关研究还处在初级阶段。
基于以上理论及研究基础，本研究拟通过以下三部分的研究，来观察慢性神经病理性疼痛大鼠脊髓NG2细胞的变化及其参与疼痛的相关机制：１：制作大鼠慢性神经病理性疼痛模型，观察大鼠疼痛行为学的改变（包括机械刺激50%缩爪阈值和辐射热刺激缩爪持续时间）及大鼠脊髓NG2细胞及NG2分子表达变化，初步探讨NG2细胞在慢性神经病理性疼痛中的的作用；2：体外培养大鼠NG2细胞，观察其膜表面AMPA 受体激活后NG2分子与疼痛相关介质表达的变化；构建大鼠NG2基因的shRNA慢病毒载体，观察RNA干扰下调NG2分子表达后，NG2细胞AMPA受体活化后疼痛相关介质表达的改变；3：将大鼠NG2基因的shRNA慢病毒载体注射到慢性神经病理性疼痛模型大鼠蛛网膜下腔，观察脊髓NG2细胞疼痛相关介质表达的变化及其对疼痛的影响。
华中科技大学博士学位论文研究方法与结果1.慢性神经病理性疼痛大鼠脊髓NG2细胞及NG2分子表达的变化方法: 选择成年雌性Sprague-Dawlye大鼠96只，体重220~250g，随机分为三组，对照组（Naïve组，n=24），不做任何处理；假手术组（Sham组，n=24），于大鼠背部切开皮肤，分离肌肉直至L5横突，咬开横突，暴露L5脊神经后缝合肌肉与皮肤；神经病理性疼痛模型组（Spinal nerve ligation，SNL组，n=48)，于大鼠背部切开皮肤,分离肌肉直至L5横突，咬开横突，暴露L5脊神经，用丝线结扎并剪断L5脊神经，缝合肌肉与皮肤。
观察术前、术后3d、7d、14d、21d、28d的术侧后趾对机械刺激的50%缩爪阈值和辐射热刺激的缩爪持续时间；于相同时点取脊髓腰膨大组织(每个时点随机选择4只)，制作冰冻切片后作免疫荧光染色以观察脊髓腰膨大背角组织中NG2细胞的改变；同时于相同时点提取SNL组大鼠术侧脊髓腰膨大组织(每个时点随机选择4只)的蛋白质，Western blot分析以检测NG2分子的表达变化。
结果：术前各组大鼠术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值与辐射热刺激缩爪持续时间差异无统计学意义（P>0.05）；与术前相比，Naïve组与Sham组大鼠各时点术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值与辐射热刺激缩爪持续时间差异无统计学意义（P>0.05），SNL 组大鼠术后3天开始各时点术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值明显降低，辐射热刺激缩爪持续时间明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与Sham组相比， SNL组大鼠术后3天开始各时点术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值明显降低，辐射热刺激缩爪持续时间明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。
免疫荧光染色结果显示，SNL组大鼠术后第7d、14d、21d术侧脊髓腰膨大背角组织中NG2细胞明显活化，可见胞体增大，突起增多。
NG2细胞数目稍增多，但与术前相比，差异无统计学意义（P>0.05）；Western blot 检测结果显示，SNL组大鼠术后第7d、14d、21d术侧脊髓腰膨大组织中NG2的表达量明显增加，与术前相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
华中科技大学博士学位论文2.体外培养NG2细胞表面AMPA受体活化后疼痛相关介质表达的改变方法：使用percoll不连续梯度离心法从Sprague-Dawlye大鼠乳鼠海马中分离培养NG2细胞，免疫荧光染色鉴定细胞性质，流式细胞技术检测细胞纯度。
构建大鼠NG2基因的shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi及对照慢病毒载体LV-Con-RNAi，并检验慢病毒载体的干扰效能。
体外培养NG2细胞接种于6孔板中，分为三组：对照组（n=12）：不添加任何试剂；AMAP组（n=12）：加入AMPA受体激动剂AMPA0.5mM；AMPA+CNQX 组（n=12）：同时加入AMPA受体激动剂AMPA0.5mM与AMPA受体拮抗剂CNQX50μM。
于加药后1h、6h、12h、24h（每时间点3孔）使用Real-time PCR检测细胞NG2分子、神经营养因子BDNF、NGF与细胞因子IL-1β、TNF-α表达的变化。
体外培养NG2细胞接种于6孔板中，分为两组：对照组（n=3）：加入LV-Con-RNAi 4d后加入AMPA受体激动剂AMPA0.5mM；实验组（n=3）：加入LV-NG2-RNAi 4d后加入AMPA受体激动剂AMPA0.5mM。
于加药后12h使用Real-time PCR检测细胞NG2分子、神经营养因子BDNF、NGF与细胞因子IL-1β、TNF-α表达的变化。
结果：成功体外分离培养了大鼠NG2细胞，细胞纯度可达80%以上。
构建的慢病毒载体LV-NG2-RNAi的滴度可达8×108 TU/ml，干扰效率可达80%以上。
Real-time PCR检测结果显示，NG2细胞表面AMPA受体活化后NG2、BDNF、NGF在给药后1h、6h、12h、24h表达增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；IL-1β在给药后6h、12h、24h表达增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；TNF-α在给药后1h、6h、12h表达增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
RNA干扰下调NG2分子表达后，Real-time PCR检测结果显示，NG2细胞表面AMPA受体活化后NG2表达降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；BDNF、NGF、IL-1β、TNF-α表达降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
3.鞘内注射NG2-shRNA慢病毒载体对大鼠神经病理性疼痛的影响方法：选择成年雌性Sprague-Dawlye大鼠48只，体重220~250g，随机分为四组：对照组（Naïve组，n=12）；神经病理性疼痛模型组（SNL组，n=12)；鞘内注射LV-Con-RNAi华中科技大学博士学位论文后7d制备神经病理性疼痛模型组（SNL+Con组，n=12) ；鞘内注射LV-NG2-RNAi后7d 制备神经病理性疼痛模型组（SNL+NG2组，n=12)。
术后7d使用western blot 检测大鼠脊髓腰膨大组织NG2蛋白的表达；同时提取大鼠脊髓腰膨大组织中NG2细胞，使用流式细胞技术检测NG2细胞神经营养因子BDNF、NGF与细胞因子IL-1β、TNF-α表达的变化；于术前、术后3d、7d、14d、21d、28d观察术侧后趾对机械刺激的50%缩爪阈值和辐射热刺激的缩爪持续时间。
结果：western blot 检测结果显示，与Naive组相比，SNL组和SNL+Con组大鼠脊髓腰膨大组织中的NG2蛋白表达量增高（P<0.05），SNL+NG2组大鼠脊髓腰膨大组织中的NG2蛋白表达量无明显改变（P>0.05）。
流式细胞技术检测结果显示，与Naïve组比较，SNL组和SNL+Con组大鼠脊髓腰膨大组织NG2细胞BDNF、NGF表达增多，但SNL+NG2组大鼠脊髓腰膨大NG2细胞BDNF、NGF表达无明显改变；与Naïve组比较，SNL组、SNL+Con组和SNL+NG2组大鼠脊髓腰膨大组织NG2细胞IL-1β、TNF-α表达均增多。
行为学观察结果显示，术前各组大鼠术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值与辐射热刺激缩爪持续时间差异无统计学意义（P>0.05）；SNL组与SNL+Con组大鼠从术后3天开始各时点术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值降低，与Naïve组比较差异有统计学意义（P<0.05）；SNL+NG2组大鼠从术后14天开始各时点术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值降低，与Naïve组比较差异有统计学意义（P<0.05）。