第四章白细胞检验的基本方法第一节白细胞功能的检验一、墨汁吞噬试验【目的】掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。

【实验原理】墨汁吞噬试验（ink phagocytosis test）是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4h，涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。

【材料】1．器材试管、移液管、微量移液器、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。

2．试剂（1）肝素：配成6U/ml水溶液。

（2）制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5ml，以优质中国块墨或印度墨，以100r/min 研磨3min。

所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。

（3）瑞氏染液等。

【方法步骤】1．取小试管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。

2．加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。

3．置37℃温育4h。

4．取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。

5．油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。

6．判断结果根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度：阴性：细胞内未见吞噬墨粒。

阳性：(+) 细胞内吞噬有小墨粒1～5个。

(++) 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。

(+++) 细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。

(++++) 细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。

7．计算吞噬率及吞噬指数吞噬率（%）= ×100%吞噬指数=【注意事项】肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。

以每100μl血用0.3U肝素为最适宜。

【参考范围】成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186；成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。

【临床意义】临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型有一定参考价值。

粒细胞仅成熟阶段才具有吞噬功能，单核细胞幼稚阶段和成熟阶段均具有吞噬能力。

AML-M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。

AML-M2、ALL和AML-M3吞噬试验均为阴性，AML-M4呈阳性反应。

CML的成熟粒细胞吞噬能力明显降低。

二、白细胞吞噬功能试验【目的】掌握白细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。

【实验原理】白细胞吞噬功能试验（leukophagocytic function test），是将待测的白细胞与葡萄球菌混合，37℃温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬，涂片染色后，在显微镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况，计数吞噬细菌的白细胞数以及被吞噬的细菌总数，计算吞噬率和吞噬指数，据此反映中性粒细胞的吞噬功能。

【材料】1．器材接种环、小试管、微量细胞培养板、水浴箱、载玻片、显微镜等。

2．试剂（1）制备菌液：取在琼脂斜面上或平板上培养24h的白色葡萄球菌菌苔，用PBS（0.015mol/L pH6.4）洗2次，沸水浴15～20min灭菌。

将灭活菌液混悬于20% FCS-RPMI1640培养液中，用比浊法调整细胞浓度至5×1010/L，置4℃备用。

（2）100U/ml肝素、甲醇、吉姆萨染液等。

【方法步骤】1．于微量细胞培养板孔内（或小试管内）加100U/ml肝素1滴，无菌采集末梢血3滴，与孔内抗凝剂立即混匀。

2．向孔内（或小试管内）加白色葡萄球菌悬液3滴，混匀。

3．置有盖湿盒内，37℃温育30min，每10min轻摇一次。

4．用滴管取1滴培养液，推成薄片，甲醇固定，吉姆萨染色、干燥。

5．镜检计数油镜下观察计数200个中性粒细胞，记录吞噬细菌的细胞数，以及各个细胞吞噬的细菌总数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬率（%）= ×100%吞噬指数=【注意事项】1．所用器材要清洁。

2．抗凝剂用量应适当，过高会抑制吞噬功能，过低则易出现血液凝固。

3．要严格掌握吞噬的时间和条件。

细菌与细胞比例以1∶1～10为宜。

4．涂片要薄，以便尽量减少因细菌重叠在细胞上而误以为吞噬的错误。

5．计数时应取载玻片前、中、后三段计数，以提高准确性。

6．本试验采用光学显微镜检查，分辨率不够高，有时难以准确计数吞入的细菌颗粒，应认真识别。

7．应根据各室的具体方法建立本室参考范围，以便客观地判定被测标本中性粒细胞的吞噬能力。

【参考范围】吞噬率：健康人为61.4～64.2%。

吞噬指数：健康人为1.01～1.11。

【临床意义】白细胞吞噬功能是其最重要的生物功能之一，本试验可作为判断机体白细胞功能状态，诊断白细胞本身所致疾病的参考。

1．吞噬率和吞噬指数增高，反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强，常见于细菌性感染。

2．吞噬率和吞噬指数降低，见于机体免疫功能低下；营养、代谢、肿瘤等因素致白细胞分化不良或不成熟，如粒细胞性白血病，多发性骨髓瘤等；机体存在明显抑制白细胞的因素，如免疫抑制剂、抗白细胞抗体等。

三、血清溶菌酶活性试验【目的】掌握血清溶菌酶活性试验的原理、方法、注意事项和临床意义。

【实验原理】血清溶菌酶活性试验（serum lysozyme activity test），是利用溶菌酶能水解革兰氏阳性球菌细胞壁的乙酰氨基多糖成分，使细胞壁裂解，用对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性。

（一）平板打孔法【材料】1．器材接种环、毛细滴管、无菌打孔器（孔径5mm左右）、水浴箱、测量尺等。

2．试剂（1）等渗缓冲液(pH 6.4)：A液：磷酸二氢钾9.07g，氯化钠5.0g，溶于1 000ml蒸馏水中。

B液：磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)23.87g，氯化钠5.0g，蒸馏水加至1000ml。

A液、B 液以10∶3比例混合，调至pH6.4。

（2）制备溶壁微球菌：①制备营养琼脂斜面培养基：取琼脂4.3g，加牛肉浸膏1.0g，蒸馏水100ml，浸10min后煮沸，使其完全溶解，倒入若干大试管，加塞，高压消毒15min，取倾向位室温冷却，置4℃冰箱保存，备用；②接种：溶壁微球菌在使用前于琼脂斜面培养基上传代一次，试验前按常规接种微球菌于斜面，置37℃培养24～48h，即可长出黄色菌落；③制备细菌悬液：用无菌蒸馏水洗下菌苔，2000r/min离心30min，弃上清。

再加蒸馏水轻轻混匀，2000r/min离心30min，弃上清，称沉淀物湿重，用无菌蒸馏水配成100g/L的浓菌液（菌液应在临用前配制，不宜存放过久），70～80℃加热灭菌，备用。

（3）1%琼脂：称琼脂粉1g，加入1/15mol/L pH 6.4 PBS 100ml。

（4）溶菌酶标准液：取溶菌酶标准品，用1/15mol/L pH 6.4 PBS制成5、25、100mg/L稀释液。

（5）被检血清。

【方法步骤】1．制备溶壁微球菌琼脂平板取已配制好的菌液1ml，加到50～60℃已溶化的1%琼脂中，摇匀，倾注平板（直径7～9cm平板加1%琼脂15ml），待冷凝。

2．打孔用打孔器在溶壁微球菌琼脂平板上打孔，孔间距18~20mm，用牙签挑去孔内琼脂。

3．加样用毛细滴管吸取血清，加入琼脂孔内。

同时在另一孔内加满溶菌酶标准液作为阳性对照。

4．温育置25～30℃温育18～24h，观察结果。

5．制备标准曲线在每批测定同时，将各种浓度的溶菌酶标准液加入小孔中，同上法测定溶菌环的直径。

在半对数纸上，以溶菌酶浓度为纵坐标（对数坐标），溶菌环直径为横坐标，绘制标准曲线。

从曲线上查出每毫升待检品所含溶菌酶的微克数。

6．判断结果加血清孔和溶菌酶标准液孔周围的溶壁微球菌被溶解，可见圆形透亮区，即溶菌环。

溶菌环的直径大小与溶菌酶的含量成正比。

【注意事项】测量标准品与待检样品溶菌现象的间隔时间应尽量缩短，最好能在同一块板上备有标准品的对照，以便比较。

（二）比浊法【材料】1．器材接种环、试管、721型分光光度计、水浴箱、微量移液器等。

2．试剂（1）等渗缓冲液(pH 6.4)：同平板打孔法（2）制备溶壁微球菌：同平板打孔法。

将制备的菌液过滤，取上清液于分光光度计600nm波长处，以缓冲液调零，调节菌液浓度使其光密度为0.4，冰箱保存。

（3）制备溶菌酶标准液：称取干燥溶菌酶2mg，用pH6.4的等渗缓冲液溶解，其酶浓度为lmg/ml(1000μg/ml)，储存液置冰箱保存，备用。

溶菌酶应用液则取0.1ml溶菌酶储存液加4.9ml缓冲液，稀释50倍，其酶含量为20μg/ml。

【方法步骤】1．将菌液置37℃水浴中预温2min。

2．抽取患者血液，分离血清，按表4-1进行操作。

表4-1 溶菌酶测定步骤加入物标准管菌液对照管测定管1 2 3 4 5 6微球菌液(m1) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0缓冲液（μ1）20 40 60 80 100 一溶菌酶应用液(μ1) 80 60 40 20 一一(每隔1min加入)血清(μ1) 100混匀，每管于37℃水浴中准确温育10min，取出即加反应终止液5mol/L NaOH(ml) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.053．以缓冲液调零，600nm波长处比浊，检测各管的光密度。

4．计算-5．制备标准曲线以测得各标准管的光密度为纵坐标，各标准管所含标准酶浓度为横坐标（第1管含酶16μg/ml，依次为12μg/ml，8μg/ml，4μg/ml），菌液对照管的光密度为零点，在坐标纸上画一曲线。

6．根据标准曲线查出被测血清样品所含溶菌酶的量。

【注意事项】1．菌液4℃保存比较稳定。

溶菌酶标准液以高浓度4℃保存为佳。

2．每批溶菌酶样品的测定须同时作标准管与菌液对照管的测定。

3．血清标本4℃保存10d，酶活性基本不变。

4．该法可同时用于测定尿中的溶菌酶活性，但要收集24h尿量，并加防腐剂，所得结果乘以尿量。

5．该法只适用于测定较窄浓度范围的溶菌酶，因此，测定前应先将待检样品的浓度作适当调整，使之适用于限定的测定范围。

6．细胞溶菌酶测定血和离心后的菌液各1滴，混合后制成涂片，置含湿纱布玻皿内，于37℃温育30min，干燥后瑞氏染色、镜检。

细胞周围菌少，变细、变淡，并可见透明环为阳性。

【参考范围】血清5～15mg/L；尿0～2mg/L。

【临床意义】人体血清中的溶菌酶，主要来自血中的单核细胞和粒细胞，其中以单核细胞含量最多。

在中性粒细胞中，从中幼粒到成熟粒细胞，其溶菌酶的含量可随细胞的成熟程度而增高。

在嗜酸性粒细胞，除中幼阶段外，其余均无此酶。

淋巴细胞中含量极低。

血清和血浆中的溶菌酶大部分是由破碎的白细胞所释放。

白血病患者血清溶菌酶含量的变化很大，与其细胞类型有密切关系。