基因工程在治疗1型糖尿病方面的研究进展与发展【摘要】近年来, 随着人们对糖尿病本质的深层次揭示和现代分子生物学手段的发展, 糖尿病,尤其是1型糖尿病基因治疗的内容不断增加。

本文总结了利用合适的启动子载送胰岛素原的cDNA, 刺激新的B细胞生成以达到恢复胰岛素的生理性分泌及改善或避免破坏B细胞免疫应答的1型糖尿病基因治疗进展，并展望其未来发展方向。

【关键词】 1型糖尿病；基因治疗；病毒载体；B细胞工程自上个世纪以来, 胰岛素的发现和其类似物的不断发展挽救了无数1型糖尿病患者的生命。

但外源性胰岛素及其类似物的补充治疗存在需要多次注射、严密监视血糖及无法按生理需求分泌等缺陷。

随着新病毒载体的成熟运用, 载送方式的不断改进以及治疗思路的不断扩展, 科学家们开始尝试用基因治疗技术来治疗1 型糖尿病。

1型糖尿病( Type 1 diabetesme llitus, T1DM )的主要病因与自身免疫对于机体胰岛B细胞的破坏有关。

目前研究人员尝试通过以下三种策略来平稳控制血糖。

首先是直接载送具有合适启动子的胰岛素原cDNA 到胰腺以外的部位(通常是肝), 通过异位分泌胰岛素来维持正常血糖水平。

其次是通过刺激新的B细胞的生成来促使胰腺恢复原来的功能。

第3种思路则是改善胰岛B细胞的自身免疫反应。

下面就1 型糖尿病胰岛素基因治疗研究现状分别从上述3 个方面作一综述。

1.利用合适的启动子载送胰岛素原的cDNA1型糖尿病最简单直接的基因治疗法是通过载送胰岛素原的cDNA来替代死亡B细胞的功能。

通常选择肝细胞为基因送载的目的部位, 这是由于肝脏具有合成糖代谢相关酶及运载蛋白的功能。

目前已用于此基因转移的载体有: ( 1) 逆转录病毒载体。

( 2) 脂质体载体。

( 3) 腺相关病毒载体等。

逆转录病毒载体由于构建简单, 宿主范围广, 可整合入宿主细胞基因组中获得稳定表达等优点, 而成为目前各种基因治疗实验中应用最广泛的载体。

有研究显示, 将含有人胰岛素原基因的重组逆转录病毒载体注入大鼠门静脉后, 可在肝脏获得5% ~15% 的基因转移效率, 并可使其表达持续6 个月, 阻止大剂量STZ 诱导的糖尿病鼠高血糖、体重下降、酮症酸中毒以至死亡［1］。

然而逆转录病毒载体也有其缺点, 它只能感染分裂期的细胞, 在体内直接基因转移时需要采取部分肝切除等方法促进细胞分裂增殖, 这使其在活体动物以及人的直接应用受到限制, 另外, 它缺乏靶向性, 随机整合, 不可避免的产生安全性问题。

传统的中性脂质体载体是将磷脂、胆固醇或其它脂类的乙醚溶液加入DNA 溶液中, 通过处理得到带DNA 的脂质体小泡, DNA 被包裹在脂质体膜内部, 可与细胞膜融合被细胞内吞而实施基因转移。

这种方法在胰岛素基因活体直接基因转移研究中应用较早。

八十年代已有学者将含有胰岛素基因的质粒与中性脂质体作用后注入大鼠体内, 发现在肝组织中可检测到转入基因的存在, 并获得一过性血糖下降和血浆胰岛素水平升高。

1987 年起出现了一系列阳离子脂质体转染试剂, DNA 通过与阳离子之间的相互作用形成DNA－脂质体复合物再被细胞捕获并最后表达, 这大大提高了脂质体的基因转染效率。

目前认为, 影响脂质体活体直接基因转移效率的因素有: ( 1) 启动子因素。

有研究比较了巨细胞病毒( CMV) 启动子、SV40 启动子、腺病毒启动子及胸苷激酶( TK) 启动子引导氯霉素乙酰基转移酶基因在大鼠体内转移表达效率, 发现CMV 启动子最高, 而TK 启动子效率最低。

还有研究发现, 在各种启动子引导荧光酶( luc) 基因表达的实验中, CMV启动子可在肌肉中获得最高表达效率。

( 2) 脂质体的组成因素。

研究发现在活体直接基因转移时,含有胆固醇的脂质体可获得最高转移效率。

( 3) DNA 与脂质体的比例。

Thierry 等认为经静脉基因转移时DNA 与脂质体的最佳比例为0. 08(wt/wt) , 而Egilmez 等认为这个比例应在1 1~ 1 4( u g/nmol) 之间( 4)DNA 的用量。

Thierry 等在研究luc 基因经静脉注入小鼠体内后的表达情况时发现, 组织中luc水平随DNA 用量增加而逐渐增高, 当DNA 用量增至100u g 以上时, 组织中luc水平不再继续增高甚至开始下降。

当前在基因治疗领域, 脂质体尤其是阳离子脂质体介导基因转移已成为一种最具创新性的、高效的转染技术。

然而大量研究表明, 脂质体介导的活体直接转移的基因表达是一过性的, 如何充分利用它的高效性和安全性, 使其介导转移的基因长期稳定表达成为学者们今后需要研究的重要课题。

腺相关病毒( AAV) 载体由于其位点特异性整合而在近年倍受重视。

与其它病毒性载体相比, AAV载体具有以下优点: AAV 无致病性, 人类为自然宿主, 安全性较高; AAV 基因组可克隆入质粒, 载体构建简单; AAV 载体可将外源基因定点整合于人类19号染色体长臂,基因表达稳定;AAV 颗粒稳定, 可通过离心浓缩提高病毒滴度达1012 cfu/ml。

最近的研究表明,腺病毒是最好的有效载体系统。

它可以选择性的将基因转移到胰岛, 但是要经受免疫应答反应和载体的细胞毒作用。

完全删除病毒成分的腺病毒载体可以避免这一问题, 它没有毒副作用, 可以选择性地将基因转移到胰岛上, 且胰岛素的表达具有长效性和高效性, 基因突变率低, 对体内重要基因的表达几乎不产生影响。

通过探索不同的基因转染路径(腹膜内注射, 导管内注射, 静脉内注射) 和研究不同血清型的AAV 载体( ssAAV, dsAAV ) , 以研发广泛、高效和稳定的转基因表达体系。

研究证明, 几乎整个胰岛都可以表现出基因转移, 但使用不同的转移方法和载体表现出不同的效率和模式。

经腹腔和静脉内的AAV8注射可有效的转染外分泌细胞, 使之像内分泌细胞一样分泌胰岛素, 且AAV8在腹腔注射后可以广泛的分布于肝、心、肌肉等。

而AAV 6的胰腺导管内传递则表现出很高的效率, 选择性更强。

与腹膜内和静脉内注射相比，导管内注射AAV 6是基因转染的最佳方法。

其最大优点在于病毒的需求量少, 病毒也较少侵及非胰腺器官和组织, 更适用于大型动物和人类。

dsAAV比ssAAV 更适合于基因转染, 因为ssAAV 产生的胰岛的基因转染相当有限。

故导管内注射dsAAV6是较为理想、广泛、高效和稳定的转基因表达体系。

目前，人们还在持续不断地寻找和改进能提高基因表达效率的分子生物学手段, 如以低压脉冲电流介导的体内转染方法——电穿孔法( e lectroporation) 能显著提高基因表达效率, 也被用于胰岛素基因的体内转染, 其安全、高效的特点正受到人们越来越多的关注, 成为一种很有前途的体内转染方法。

2. 刺激新的B细胞生成以达到恢复胰岛素的生理性分泌该方法的主要思路是将胰岛素合成或调控基因导入靶细胞，使其转化为胰岛B细胞。

依转移基因的靶细胞不同可分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗两种途径。

因转基因在受体细胞的随机整合性和可传代性, 以及其对人类长期影响的不能完全预知, 并涉及伦理学问题, 因此目前尚不考虑生殖细胞基因治疗途径。

迄今临床采用的均属体细胞基因治疗. 这种基因治疗方法有两种治疗方案可供选择: 一是将病人的体细胞取出作原代培养, 将目的基因转入后再移植回该病人体内, 这样就避免了组织排异反应带来的问题; 二是采用转入胰岛素基因后培养的传代非B细胞系。

这两种治疗方案采用的技术方法大致相同, 然而, 将目的基因导入原代培养的细胞较导入传代培养的细胞系困难许多, 技术要求也更高, 目前用于糖尿病基因治疗研究的主要有三类靶细胞: :一类为胸昔激酶缺乏(Lt k 一) 的成纤维细胞; 一类为肝细胞; 第三类为来自垂体前叶的A C T H 瘤细胞(A t T 一2 0) 。

L tk 一细胞为稳定传代细胞系, 具有易于培养、增殖、传代、转染和移植并表达分泌蛋白质的特点。

肝脏为体内大器官, 是葡萄糖代谢和蛋白质合成的重要场所, 进食后糖和其它营养成分首先通过门静脉进入肝脏并形成肝一胰联系; 肝细胞具有与B 细胞类似的一些组织细胞特点, 除参与葡萄糖代谢和蛋白质合成外, 还表达B 细胞分泌胰岛素所需的特异性葡萄糖转运蛋白(G L U T Z ) 和葡萄糖激酶(G K ); 其特殊的解剖部位和血循环特点,静脉或腹腔途径移植转导的细胞较易进入肝、脾等内脏, 而且可以通过这两条途径直接进行基因转移, 因此肝细胞是糖尿病基因治疗非常有前途的靶细胞。

另外A t T 一20 细胞为神经内分泌细胞,具有一般内分泌细胞分泌激素的特有结构和功能。

研究发现上述三类细胞经转导人前胰岛素。

D N A 后均能合成分泌胰岛素, 转染的阳性克隆细胞, 注射于糖尿病鼠腹腔后, 糖尿病鼠高血糖状态明显改善, 体重恢复。

这些实验显示利用胰外组织进行糖尿病体细胞基因治疗是可能的。

但前两者表达产物为人前胰岛素, 而后者又称A tT 一2 0 ins 细胞则分泌成熟胰岛素。

晚近证实A t T 一2 0i n s 细胞分泌颗粒中含有B 细胞分泌颗粒的肤酶PC Z和P C 3, 因而可以加工前胰岛素为成熟胰岛素, 显示神经内分泌细胞作为糖尿病基因治疗的靶细胞具有特殊意义。

Ⅰ型糖尿病基因治疗中最为关键和复杂问题是胰岛素的表达调控问题，分泌水平过高则造成低血糖死亡, 分泌水平过低又不能满足治疗要求。

目前认为, 有效的生理性调控序列分别为: 磷酸烯醇式丙酮酸激酶( phosphoeno lpyruvate carboxyk inase, PEPCK )、肝丙酮酸激酶( liver-pyruvate k inase, L-PK ) 和葡萄糖-6-磷酸酶( g lucose-6-phosphatase,G6Pase) 的启动子。

PEPCK 启动子可同时受血糖和血浆胰岛素的反馈调控, 但在血糖明显升高时其作用将受到抑制而使胰岛素的产量减少, 目前已不多用。

L-PK和G6Pase是相对理想的启动子, 但作用不够强大,基因表达效率不高, 影响了降糖的效果。

近年, 人们又发现了一种新的调节因子) ) ) Foxa l ( 肝核因子) , 它是属于Foxa家族的, 来源于内胚层器官,可以对血糖的稳态进行调节。

Foxal可以直接调节胰高血糖素, 因为其与胰高血糖素的启动子是绑定在一起的。

Foxal对胰岛素的分泌有间接影响,UCP2 (线粒体解耦联蛋白) 的启动子是Foxa l负性依赖性的。

而UCP2可以通过氧化磷酸化来抑制胰岛素分泌。

故Foxal 可以用来维持血糖的稳态。

但有许多问题仍需要进一步进行验证。

2000年，Cheung 等发现位于胃、十二指肠、空肠的K 细胞具有较高的GK 表达能力。