DNA分子 ，完
成转化过程。
[思维激活2] 为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？ 提示 微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对 较少的优点，因此是基因工程常用的受体细胞。
1．基因表达载体的构建步骤 (1)一般用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同 的末端。 (2) 将 切 下 的 目 的 基 因 片 段 插 入 质 粒 的 切 口 处 ， 再 加 入 适 量 DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程 (如下图)。
单链DNA 与引 物结 合、
DNA 聚合 酶 大量目 的基因
蛋白质 的氨基 酸序列
推测
mRNA 的核苷 酸序列
推测 基因的 核苷酸 序列
化学 合成 目的基因
优点 操作简单
专一性
可在短时间内 专一性强，可产
大量扩增目的 生自然界中不存
基因
在的新基因
工作量大、 操作过程较 需要严格控制 缺点 盲目性大、 麻烦，技术 温度、技术要
1．2 基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
1．基因工程的基本操作程序 (1) 目的基因 的获取。 (2) 基因表达载体 的构建。 (3)将目的基因导入 受体细胞 。 (4)目的基因的 检测与鉴定 。
2．目的基因的获取 (1)目的基因：主要是指 编码蛋白质的基因，也可以是一些具
有 调控作用 的因子。
【巩固1】 下列获取目的基因的方法中需要模基
因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A．①②③④
B．①②③
C．①②④
D．②③
解析 PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的 氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法则是 以目的基因转录成的信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下，先 反转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。①、④则均 不需要模板。 答案 D
时间后移植到雌性动物的输卵 的基因导入动物 射法
管或子宫内→使其发育成转基 细胞的方法
因动物
Ca2＋处理微生物细胞→感受
微生 物细 胞
态细胞→将基因表达载体在缓
感受态
简便、经济、有
冲液中与感受态细胞混合→一
细胞
效
定温度下促使感受态细胞吸收
DNA分子
特别提醒 (1)基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也 是基因工程的核心。 (2)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵和体细胞，但常用体细 胞。 (3)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵。受精卵作为受体细胞 具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。而动物体 细胞的全能性受限。
基因表达载体的构建与转化
1．基因表达载体的构建 (1)基因表达载体的组成 ①启动子 位置：基因的首端。 功能：是 RNA聚合酶 识别和 结合的部位，驱动基因转录出 mRNA 。
②终止子
位置：基因的尾端。
功能：使 转录 在所需要的地方停止下来。
③标记基因：鉴别受体细胞中是否含有 目的基因 。
(2)基因表达载体的功能 使目的基因在受体细胞中 稳定存在
[思维激活1] PCR过程中，需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶 应具有什么特点？ 提示 PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需 要 解 旋 酶 ； 由 于 PCR 过 程 温 度 较 高 ， 所 以 需 要 能 耐 高 温 的 DNA聚合酶。
1．提取目的基因方法的比较基因的构建 方植 枪法 体细胞或组织中→目的基因表达 的基因转化方法
物
含目的基因的溶液→滴加在柱头 细 花粉
胞
上(或用含目的基因的溶液处理 管通
简便、经济，我
花粉粒)→花粉粒吸入目的基因 国科学家独创 道法
→授粉→目的基因表达
目的基因片段→受精卵的核内
动物 细胞
→受精卵经胚胎早期培养一般 最为有效地将目 显微注
【巩固2】 请据图回答下列问题。 (1)基因工程的核心步骤是_________________________。 (2)利用________技术可以获得大量的目的基因。该技术利用 ________的原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其 数量呈指数增长。 (3)图中________位于目的基因的首端， 是________识别和结合的部位。抗生 素抗性基因的作用是作为________， 用 于鉴别受体细胞中是否导入了目的 基因。
据图回答下面的问题。 (1)图中基因组______(填“小于”“等于”“大于”____________________________； A、C过程中________(填“可以”“不可以”)使用同一种探针筛 选含目的基因___和________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所 用酶的显著特点是_____________________________________。
合成DNA片段或基因
(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 (2)原料：均为四种脱氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶 联系 (4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连 接脱氧核苷酸
特别提醒 (1)真核细胞的基因编码区含有不能表达的内含子，因 此，不能直接用于基因的扩增和表达。获得真核细胞中目的基因 时，一般用人工合成的方法。 (2)PCR扩增的过程：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引 物与单链相应的互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延 伸，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物同样可以和引物 结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一培，即成指数 形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
目的基因导入受体细胞的结果分析
说明：上图中发生②与发生①相比，②会使目的基因的遗传特性 得以稳定维持和表达，原因是在进行细胞分裂时，细胞核上的 DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性 状的稳定性，而①细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一 定含有目的基因。
【巩固3】 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达 其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的 基因检测和鉴定的是 ( )。 ①检测受体细胞是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致 病基因 ③检测目的基因是否转录mRNA ④检测目的基因 是否翻译蛋白质 A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④
，并且可以遗传给下一
代，使目的基因能够 表达 和发挥作用。
(3)基因表达载体的构建
一般用同一种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接
酶把两者连接。
2．将目的基因导入受体细胞
(1)转化的概念 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 维持稳定 和表达 的过程。 (2)将目的基因导入植物细胞 ① 农杆菌转化 法：将目的基因导入双子叶植物和祼子植物。 ② 基因枪 法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。 ③ 花粉管通道 法：我国科学家独创的一种方法。
专一性差 要求过高 求高
适用范围小
2．PCR技术与DNA复制的比较
比较项目 解旋 方式
场所 区 别酶
温度
结果
DNA复制 解旋酶催化
细胞内(主要在细胞核内) 解旋酶、DNA聚合酶 细胞内温和条件 合成DNA分子
PCR技术
DNA在高温下变性解旋
细胞外(主要在PCR扩增 仪中)
耐热的DNA聚合酶 控制温度，需90 ℃～95 ℃高温
解析 目的基因的检测包括：首先检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针，使DNA探针与基 因组DNA杂交；其次检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是 用基因探针与mRNA杂交；最后检测目的基因是否翻译了蛋白质， 方法是进行抗原—抗体杂交。
目的基因的获取
【例1】 水稻种子中70%的磷以植酸形式存在。植酸易同铁、钙 等金属离子或蛋白质结合排出体外，是多种动物的抗营养因 子，同时，排出的大量磷进入水体易引起水华。为从根本上 解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育 低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。
解析 本题考查基因表达载体的组成及其构建。基因工程的核心 步骤是基因表达载体的构建；目的基因的获取方法很多，其中 PCR技术能迅速获得大量目的基因，其依据的原理是DNA双链复 制原理；基因表达载体必须包含目的基因、启动子、标记基因、 终止子，其中启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和 结合的部位，驱动基因转录为mRNA，抗生素抗性基因作为标记 基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。 答案 (1)基因表达载体的构建 (2)PCR DNA双链复制 (3)启 动子 RNA聚合酶 标记基因
思维导图：深度剖析 基因组包含本物种全部遗传信息，cDNA仅 技术扩增目的基因，可利用 DNA或cDNA作为模板，该扩增过程需耐高温的DNA聚合酶参与。 答案 (1)大于 (2)逆转录酶 可以 (3)DNA cDNA 耐高温
(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质 ①方法： 抗原—抗体杂交 。
②结果：若有杂交带出现，则表明目的基因
已形成蛋白质产品
。
2．个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的 接种实验，以确定是否有抗性及抗性
程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
[思维激活3] 进行目的基因导入及转录检测时，均用到DNA探针， 该探针的脱氧核苷酸序列如何？其检测依据是什么？ 提示 把“目的基因片段”进行放射性同位素标记或进行荧光 标记，用标记好的基因片段做探针，与受体生物的基因组 DNA进行杂交，如果有杂交带出现，根据分子杂交的基本原 理，说明目的基因与受体细胞基因组DNA具有同源性，也就 是说目的基因已经被导入受体细胞内，反之，则说明目的基)
PCR技 人工合成
术扩增
供体细胞中
的DNA
限制酶
许多DNA
片段
连接
过 表达载体
程
导入
受体细胞
外源DNA扩
增，产生
特定性状