利用固定化酶连续糖化生产葡萄糖试验
摘要采用再造孔分子筛作为载体制得具有高稳定性的固定化复
合糖化酶,在适宜条件下,连续供给de值13%～17%、浓度30%～33%玉米淀粉液化液,通过控制流速和温度可连续30d生产出de值95%以上,葡萄糖含量93%以上,达到结晶要求的液体葡萄糖浆。

关键词分子筛;固定化酶;连续糖化
中图分类号q532+.3文献标识码a文章编号
1007-5739(2009)14-0333-02
目前,国内利用淀粉生产葡萄糖的主要方法为双酶法,随着生产
成本的升高和葡萄糖价格的持续走低,大部分淀粉糖企业放弃了葡萄糖的生产,只有少部分以质量为优势的企业仍在生产,其利润已
经处于极低的水平。

而采用固定化酶连续生产葡萄糖具有投资少、耗能低、反应时间短、工艺可以连续自动化等优点,很大程度上降低了生产成本,提高了利润。

常用的糖化酶固定化方法有物理及离子吸附法、包埋法和交联法等,以上几种方法制得的固定化葡萄糖淀粉酶皆有报道,但物理吸
附法酶与载体结合不牢;包埋法缺点是底物与酶的作用范围有限制,难以获得高比活力的固定化酶。

由于葡萄糖价格低,使用低制备成本和高效的固定化酶对葡萄糖的生产有着重要意义。

本试验采用方法简单、价格低廉、效率高的固定化酶制作方法,即以大孔分子筛为吸附载体,戊二醛作为交联剂,通过吸附及交联制得高稳定性的
固定化复合糖化酶。

在适宜条件下,以玉米淀粉液化液为原料连续
通过装有固定化酶的反应柱,可生产出达到结晶要求的液体葡萄糖。

本试验主要研究对固定化酶连续糖化有密切影响的各种因素,从而找出适宜工业化生产的糖化条件。

1材料与方法
1.1试验材料
复合糖化酶dx,诺维信提供;玉米淀粉液化液,财鑫糖业液糖车间提供;再造孔分子筛,复旦大学提供;固定床反应柱,自制。

1.2试验方法
1.2.1固定化酶制备方法。

将复合糖化酶循环经过装有分子筛的反应柱使分子筛表面吸附一定量的糖化酶,用少量水洗去多余的酶,取浓度0.5%～1.0%戊二醛做为交联剂对其进行交联,得到吸附有糖化酶的分子筛固定化酶反应柱。

1.2.2连续糖化方法。

将车间生产的玉米淀粉液化液经过2遍脱色过滤,ph值为4.2～4.5,调整浓度,在适宜的柱温下以适当流速连续经过固定化酶反应柱,得到葡萄糖糖化液。

为了减小运行过程中反应柱酶活下降对糖化的影响,每个条件下连续糖化的反应时间都小于5d。

1.3指标检测
挂酶量测定:测定出吸附前后酶的活力,可折算出每克分子筛吸
附的酶量(其数值可反映挂酶量的大小,不代表实际挂酶量);酶活
力测定方法参照国标gb8276-2006;糖化液de值测定依照国标
gb20885-2007。

糖化液组分测定:waters高效液相色谱
仪,shodex-nh2柱,流动相ch3cn∶h2o=65∶35,流量1ml/min,示差折光检测。

2结果与讨论
2.1反应条件对连续糖化的影响
2.1.1反应温度的影响。

酶是生物催化剂,温度对酶促反应有双重影响。

升高温度一方面可以加快酶反应速度,同时也增加酶变性的机会。

酶在最适的温度下可以表现出最高的酶活力,超过或低于最适温度,都会使酶的利用率下降,因此找到最适的反应温度对反应柱的高效运行有重要帮助。

以浓度30%～33%,de值15%左右的玉米淀粉液化液连续通过反应柱,在表观流速为0.9m/h的条件下,测定温度对糖化液de值的影响(图1)。

由图1可见,不同挂酶量的反应柱,反应的最佳温度都为65℃。

考虑到糖化酶在固定化到分子筛上以后热稳定性有所下降,试验宜在较低温度下进行。

由于分子筛对酶的吸附作用比较强,这种吸附作用可能使酶更容易变性,从而使利用率下降。

在挂酶量比较高的情况下,温度在35～65℃范围内的降低对de值的影响不大,而且降低反应温度会大大提高固定化糖化酶的稳定性和延长使用寿命。

因此,在不影响糖化效果的情况下,反应适宜在较低的温度下进行。

2.1.2底物浓度的影响。

用分子筛固定化复合糖化酶水解玉米淀粉液化液时,若底物浓度过高,增加流动的困难,易造成反应柱的堵塞;若浓度过低,影响产率。

采用车间生产的de值15%左右的液化液
作为反应底物,在温度45℃,表观流速0.9m/h的条件下,测定了不同底物浓度对糖化de值的影响(图2)。

由图2可见,不同挂酶量的反应柱,在选择的浓度范围内,随着底物浓度的增加,糖化后的de值都有所下降。

底物浓度的提高可以部分减小扩散的影响,增加底物与固定化酶的接触机会,但当底物浓度增加,酶量和流量不变时,就相当于减少了单位底物所接触的酶量,从而导致de值随之下降。

在挂酶量较高的情况下,提高底物的浓度,糖化受到的影响相对比较小。

因此,在挂酶量一定的情况下,底物浓度降低有利于糖化的效果。

在工业化生产时,考虑到收率、液化效果等因素,最适底物浓度应为30%左右。

2.1.3初始de值对糖化的影响。

将生产中不同de值的液化液,调整浓度至30%左右,在温度45℃、表观流速0.9m/h的条件下连续经过反应柱,测定糖化的de值变化情况,结果见表1。

由表1可见,底物初始de值的增加,在高挂酶量时,de值的变化不大,在挂酶量较低时,对糖化de值有一定的影响,可能是由于低de 值的液化液中的底物分子量较大,不利于底物在反应柱中的扩散,从而影响糖化效果。

考虑生产中液化的成本,适宜用初始de值在13%～17%之间的液化液作为反应底物。

2.1.4流速的影响。

固定量的反应底物在反应柱中反应的时间不同,糖化的效果也不同,因此,流速对糖化的效果有着重要作用。

将浓度30%、de值15%左右的液化液以不同的流速通过45℃的反应柱,测定流速对糖化的影响情况,结果见表2。

由表2可见,流速的变化对糖化效果的影响比较大。

本试验中流量不变,表观流速每降低0.2m,每小时可增加反应时间13min(与反应柱长度有关)。

流速的减小增加了底物在反应柱中的反应时间,使底物与酶能够很好的作用,得到很好的糖化效果,但流速降低,会减小单位时间内的收率。

在高挂酶量时,流速对糖化效果的影响相对较小,因此可在提高挂酶量的基础上加快流速以获得理想的糖化效果和收率。

2.2连续糖化持续性及效果
连续糖化持续的时间长短是固定化酶的重要指标,决定着成本的高低。

液化液浓度30%、de值15%左右,在表观流速0.9m/h、柱温45℃的条件下连续通过挂酶量28 000u/g左右的反应柱,运行30d,糖化de值随时间的的变化情况如图3所示。

糖化de值在前23d维持在95%以上,连续运行30d后,糖化de值已下降至92%左右,糖化de值随时间的下降趋势明显,主要是因酶活力逐渐下降所致。

在另一试验中,通过在de值开始下降时降低流速和提高反应温度可以连续30d得到de值95%以上的糖化液,不同糖化de值时糖化液的组分如表3所示。

3结论
液化液在经过装有固定化复合糖化酶的反应柱进行连续糖化时,在一定范围内浓度的降低、初始de值的增高、流速的降低都会提高糖化效果,其反应的最适温度为65℃。

对生产中的各种条件综合考虑,适合工业化生产的连续糖化条件
为:浓度30%～35%、初始de值为13%～17%的液化液在表观流速
0.9m/h、柱温45℃下连续经过挂酶量28 000 u/g以上的固定化酶反应柱,通过在后期降低流速,提升温度可以连续30d得到de值95%以上、葡萄糖含量93%以上的糖化液,已达到生产结晶葡萄糖的要求。

4参考文献
[1] 于家波,宋富兵,陈海鹰,等.底物扩散对分子筛固定化葡萄
糖淀粉酶性能的影响[j].复旦学报(自然科学
版),1999,38(6):652-656.
[2] 宋富兵,陈海鹰,于家波,等.分子筛固定化葡萄糖淀粉酶性
能的研究[j].复旦学报(自然科学版),2000,39(4):363-367.
[3] 胡仁其,于家波,宋富兵,等.分子筛对葡萄糖淀粉酶的吸附
性能研究[j].化学学报,2000,58(10):1211-1215.
[4] dauglas d l,peter j r,yoon y l,et al.pilot plant production of glocose with glicoamylase immobilized to porous silica[j].biotechnology and
bioengineering,1976(18):253-267.。