“分子手术刀” ——限制性核酸内切酶（简称限制酶）
大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。
SmaⅠ
平末端
平末端
在对称中心的中心轴线处切开
EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
在对称中心的中心轴线两侧切开
（二）基因操作的工具
• 什么叫黏性末端？
被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
限制性内切酶
1.特点：专一性，即识别特定核苷酸序列， 在特定的切点切割。
2.来源：主要来自原核生物。 3.结果：产生黏性末端（碱基互补配对）、 平末端。 4.举例：大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ) 能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形 成黏性末端，SmaⅠ能识别CCCGGG序列， 并在C和G之间切割形成平末端 。
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
寻根问底
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
1)只能将单个核苷酸连 1)在两个DNA片段之 接到已有的核酸片段上，间形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 2)以一条DNA链为模板，2)将DNA双链上的两 将单个核苷酸通过磷酸 个缺口同时连接起来， 二酯键连接成一条互补 不需要模板 的DNA链
细胞内提取出来
关键步骤二： 抗虫基因与棉花DNA“缝合”
关键步骤三： 抗虫基因进入棉花细胞
（二）DNA重组技术的基本工具
• 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ 关键步骤一的工具：分子手术刀—限制性内切酶 关键步骤二的工具： 分子缝合针—DNA连接酶 关键步骤三的工具： 分子运输车—运载体
（三）基因操作的工具
• 问：如果把两种来源不同的DNA用同一种限 制酶来切割，会怎样呢？ 答：会产生相同的黏性末端，然后让两者的 黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的 DNA分子了。
（二）基因操作的工具
• “分子缝合针”——DNA连接酶
（二）“分子缝合针”——DNA连接 酶③类型：根据酶的来源分为两类：
来源
相同点
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”。
载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞 内去。能将外源基因送入细胞的工具就是载体。
1.作用：将外源基因送入受体细胞。 2.种类：质粒、λ噬菌体衍生物和动植物
病毒
3.质粒的特点
（二）基因操作的工具
• 作为运载体必须具备哪些条件？
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• 想一想限制酶所识别的序列有什么特点？
限制酶所识别的序列，无论是6个碱基 还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线 （如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基 是反向、对称、重复排列的。
（二）基因操作的工具
• 问：要想获得某个特定性状的基因必须要用 限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
答：要切两个切口，产生四个黏性末端。
形成磷酸二酯键
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的
磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
G
C
A
T
A
T
T
A
TAΒιβλιοθήκη CG（二）基因操作的工具
• 外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如 棉花细胞)？
4、关于限制酶说法中，正确的是（ C ） A．限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱
基序列 B．EcoRI切割的是G—A之间的氢键 C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，
只切割外源DNA D．限制酶只存在于原核生物中
练习
⑴ 定向改造生物性状 ⑵ 克服远缘杂交不亲和的障碍 ⑶ 育种周期短
基因工程的概念
基因拼接技术或DNA重组技术
生物体外 基因
DNA分子水平
剪切 → 拼接 → 导入 → 表达 人类需要的基因产物
二、基因工程的基本工具
请同学们看书，思考以下问题：
1、基因工程中三种基本工具的作用分 别是什么？
2、工具酶的作用部位分别在哪？ 3、具备什么条件才能充当“分子运输
1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3.具有某些标记基因，便于进行筛选。
如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应 的基因等。
（二）基因操作的工具
• 大肠杆菌的质粒：
最常用的质 粒是大肠杆 菌的质粒， 其中常含有 抗药基因， 如四环素的 标记基因。 复制只能在 宿主细胞内 成。
D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形 成氢键
练习
2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
练习
3.有关基因工程的叙述中，错误的是（ B D ） A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，
培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体
基因操作工具
一、基因工程的概念
基因工程又叫基因拼接技术或DNA 重组技术。该技术是在生物体外，通过 对DNA分子进行人工“剪切”和“拼 接”，对生物的基因进行改造和重新组 合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖， 使重组基因在受体细胞内表达，产生出 人类所需要的基因产物。
原理：基因重组 优点：
质粒的特点
1. 细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主 复制的小型环状DNA分子；
2. 质粒的存在对宿主细胞无影响；
3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
练习
1.以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
车”？
（一）基因工程示例
• 基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
普通棉花(无抗虫特性)
剪切
拼接
抗虫基因
重组 导入
DNA
棉花细胞(含抗虫基因)
表达
棉花植株(有抗虫特性)
• 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？
（二）基因工程的过程
• 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一： 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌