考点一 基因工程的概念及操作工具(5年13考)(2015天津、福建、重庆、浙江、江苏；2014新课标、天津、北京、山东、江苏、海南；2013全国大纲卷、广东……)一、基因工程的概念基因工程的别名基因拼接技术或DNA 重组技术操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA 分子水平 原理 基因重组基本过程 剪切→拼接→导入→表达 结果 人类需要的基因产物或生物类型 供体 提供目的基因 受体 表达目的基因 本质 目的基因在受体体内的表达 优点可定向改造生物的遗传性状二、DNA 1．限制性核酸内切酶(简称：限制酶)⎩⎪⎨⎪⎧来源：主要从原核生物中分离作用：割断两个核苷酸之间的磷酸二酯键作用特点：专一性，即限制酶可识别特定的核苷酸序列结果⎩⎨⎧ 错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端2．DNA 连接酶常用类型 E·coliDNA 连接酶 T 4DNA 连接酶 来源 大肠杆菌 T 4噬菌体 功能 连接黏性末端连接黏性末端或平末端结果都缝合磷酸二酯键，如图3.载体(1)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
(2)质粒的特点⎩⎪⎨⎪⎧能自我复制有一个至多个限制酶切割位点有特殊的标记基因1．下图为限制酶和DNA 连接酶的关系，据图回答：(1)限制酶和DNA 连接酶的作用部位相同吗相同。
(2)DNA 连接酶起作用时是否需要模板不需要。
2．探究载体所具条件的意义条 件 意 义稳定并能自我复制 目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因便于重组DNA 的鉴定和选择基因工程操作工具的综合考查导学号(经典高考题)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶切割DNA 分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：AATT C……GG……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA 除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是______________________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA 连接酶有两类，即________DNA 连接酶和________DNA 连接酶。
(4)反转录作用的模板是________，产物是_____________________________________。
若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是____________________________________________________________________。
1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸DNA DNA酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部分解为两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco R Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )A．①②③④B．①②④③C．①④②③D．①④③②若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。
下列分析合理的是( )A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。
据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为( )下列关于载体的叙述中，错误的是( )A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割考点二基因工程的基本操作程序及应用(5年24考) (2015新课标Ⅰ、福建、天津、四川、海南、江苏；2014新课标、天津、广东、重庆、北京、山东、江苏、海南；2013新课标Ⅰ、福建……)1．操作步骤：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
2．应用技术名称应用植物基因工程 培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质动物基因工程 提高动物生长速度，改善畜产品的品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体基因治疗把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗1．观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序1获取目的基因—⎩⎪⎨⎪⎧①从基因文库中获取②利用PCR 技术扩增③通过化学方法人工合成↓2基因表达载体的构建—组成⎩⎪⎨⎪⎧①目的基因②启动子③终止子④标记基因↓3将目的基因导入受体细胞—方法⎩⎪⎨⎪⎧①植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法②动物：显微注射技术③微生物：感受态细胞法↓4目的基因的检测与鉴定⎩⎪⎪⎨⎪⎪⎧①利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无②利用分子杂交技术检测目的基因的转录③利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译④利用个体生物学水平的鉴定检测重组性状的表达2．目的基因的检测和鉴定3．探究基因治疗与基因诊断的不同点原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用基因工程的操作程序的考查导学号(2015·四川卷)将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有TDNA片段能转移到植物细胞中)。
(1)过程①需用同种____________酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。
为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用________培养基。
(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是________________________________________________________________________。
(3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加________以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是_________________________________________。
(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是____________。
种植转基因抗虫棉能减少________的使用，以减轻环境污染。
下图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。
据图分析，下列叙述正确的是( )A．过程①需要DNA连接酶B．过程②需要限制性核酸内切酶C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同下列用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是( )A．通过害虫吃棉叶看其是否死亡B．转基因生物基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带C．转基因生物中提取的mRNA与DNA探针能否形成杂交带D．转基因生物中提取的蛋白质能否与抗体形成杂交带(2014·天津卷)为达到相应目的，必须通过分子检测的是( )A．携带链霉素抗性基因受体菌的筛选B．产生抗人白细胞介素8抗体的杂交瘤细胞的筛选C．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定D．21三体综合征的诊断(2015·福建卷)GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。
研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。
请回答：(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是__________________。
(2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的________限制酶进行酶切。
(3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。
为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。
图中第________泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。
(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的________与提取的蛋白质杂交。
当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行________培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
考点三蛋白质工程、转基因技术的安全性及生物武器(5年6考) (2015新课标Ⅱ、海南；2014重庆；2013广东、江苏……)1．概念理解蛋白质工程具体内容别称第二代基因工程目标生产符合人类生产和生活需要的一种新的蛋白质原理由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质结构进行改造，必须从基因入手基础蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系手段基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质关键技术基因工程基础蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系结果改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。