1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE 2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶 3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
一提取植物DNA；
二.PCR反应；
三.琼脂糖凝胶电泳；
一.提取植物DNA的步骤
(略)
二.PCR鉴定
1.制作反应体系（先混合在分装最后单独加模板）
试剂 ddH2O 10×Tap buffer(Mg2+ free) 模板DNA（3050ng/ul） 引物LP（10um） 引物RP（10um） 引物BP（10um） dNTP(各2.5mM) Tap酶（5U/ ul） 反应体系总体积 单管I（μl） 16 2.5 2 1 1 NO 2 0.5 25 20 5 混合I 160 25 10 10 单管II（μl） 16 2.5 2 NO 1 1 2 0.5 25 10 10 20 5 混合II 160 25 -
杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA 中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。 T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用
农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变 体的方法。
实验材料
野生型（Col）、ibm1突变体（SALK_023533）拟南 芥植株 IBM1(AT3G07610)是拟南芥中组蛋白修饰酶的编码基 因，能影响植物的诸多的发育和生殖过程。
4.确定每一株拟南芥的基因型，统计全班的结果计算群体中 的分离比例。
实验报告
1.电泳图+分析，确定每个单株的基因型；
基因型 +/+ +/ibm1 植株编号
ibm1/ibm1
2.全班基因型统计，计算比例，卡方检验。
基因型 株数 比例 野生型 纯合子 杂合子
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反向遗传学
则是在获得生物体基因组全部序列的
基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定 点突变、插入、缺失、置换等，再研究这些修饰对生 物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和 其编码蛋白质在生物体内的功能。
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点： 植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培 养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物， 基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
模式植物拟南芥
2000年，拟南芥全部基因组测序已经完成，是人类 首次完成了一种高等植物的基因组全序列测定。每个单 倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只 有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基 因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。 现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向 全世界的科研人员开放。研究一个特拟南芥生物资源中心订购。
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3 理论的条带长度： LP+RP: ~1200bp
RP+BP:
~900bp
三.琼脂糖凝胶电泳
1. 用 TAE 电 泳 缓 冲 液 配 置 1 ％ 琼 脂 糖 凝 胶 ； 溶 胶 后 加 入 Goldview染料； 2.25uL PCR 产 物 ， 加 5uL 上 样 缓 冲 液 (6x) 混 匀 ； 点 样 810ul于1% 琼脂糖胶上电泳, 稳压150Ｖ（5Ｖ/cm）； 3.电泳结束，在紫外成像仪下观察、拍照，然后分析条带。
ibm1突变体： 开花延迟
叶片卷曲
果荚短小 花粉粒败育
ibm1是一个隐性突变：只有纯和的突变体植株 才有与野生型的性状差异；杂合的植株表型与野 生型一致。
如何确定F2代中基因型的分离比是1：2：1？
传统遗传方法：F2代做测交或者自交； 现代分子遗传方法：PCR鉴定。
实验器具和试剂
试剂：
PCR鉴定T-DNA插入突变体的原理
T-DNA方向
T-DNA的长度在10kb左右，一般PCR反应不能跨T-DNA扩出条带。
WT：两个等位基因上都能被LP+RP扩出，而BP+RP不能扩出条带。
HM(纯合子)：两个等位基因上都有T-DNA插入，能被BP+RP 扩出， 而不能LP+RP扩出条带。
HZ(杂合子)：两个等位基因中的一个有T-DNA插入，能被BP+RP 和 LP+RP扩出条带。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的
培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
模式植物拟南芥
生长周期 形态结构
突变体的获得
插入突变（insertional mutagenesis），即将外源DNA随机插
入到拟南芥基因组中而获得其突变体。植物中最常见的插入突变方法是 T-DNA插入突变。
农杆菌转化法：
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农
模式植物拟南芥T-DNA插 入突变体的鉴定
西南大学 LOGO
目录
实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定
实验设计的思路和原理
经典遗传学
是从生物的性状、表型到遗传物质来
研究生命的发生与发展规律。一般是随机突变基因， 从表型变化入手去研究和确定基因的遗传规律、结构 特征、在染色体上的位置，并克隆基因的序列。
2.反应程序
过程 预变性 变性 退火 温度/℃ 94 94 56 时间 5min 30s
35循环
注意：
1.每管分装多少ul 2.标记清楚 3.反应前混合、离心 4.盖温，防蒸发
30s
延伸 延伸后处 理
72 72
80s 10min
PCR安排：
从F1代杂合植株自交产生的后代分离群体，提取了群 体中每个单株的基因组DNA，现在需通过PCR方法鉴 定每一单株的基因型。