基因组学与应用生物学，2010年，第29卷，第6期，第1177－1183页Genomics and Applied Biology,2010,Vol.29,No.6,1177－1183技术改进Upgrated Technology转基因大豆GTS40－3－2转化事件特异性PCR检测王恒波1,2陈平华1,2郭晋隆1陈如凯1*许莉萍11福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室,福州,350002;2农业部甘蔗及制品监督检验测试中心转基因生物产品检测室,福州, 350002*通讯作者,phcemail@摘要GTS40－3－2是抗草甘膦转基因大豆，为建立GTS40－3－2大豆转化体特异性PCR检测方法，本研究以GTS40－3－2标准品为实验材料，根据已公布转基因大豆GTS40－3－2基因与大豆基因组连接序列信息，利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物，对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测，结果显示，5对特异性引物均能够从GTS40－3－2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp 的预期产物，可用于特异性检测转基因大豆GTS40－3－2转化事件。

以转基因大豆GTS40－3－2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测，结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。

通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较，最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40－3－2品系特异性检测的最适引物。

本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。

关键词转基因大豆,GTS40－3－2,转化事件,特异性PCR检测Specific PCR Validation of Transformation Event for Transgenic Soybean GTS40－3－2Wang Hengbo1,2Chen Pinghua1,2Guo Jinlong1Chen Rukai1*Xu Liping11Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement,Ministry of Agriculture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,350002;2Quality Supervision,Inspection and Testing Center for Sugarcane and Derived Products of Ministry of Agriculture,Fuzhou,350002*Corresponding author,phcemail@DOI:10.3969/gab.029.001177Abstract GTS40－3－2is a glyphosate-tolerant transgenic soybean.In order to establish a specific PCR validation method for transgenic soybean GTS40－3－2,in this research,we employed GTS40－3－2standard sample as the ex-periment material,and designed five specific PCR primers based on the junction sequence published between transgenic soybean gene GTS40－3－2and soybean genome by using Primer5.0software to PCR validation the Tm value,specific and the amplification efficiencies from each primer.The results showed that the products size of five primers was in accordance with expected one which was279bp,238bp,470bp,490bp and257bp respec-tively from the standard reference GTS40－3－2and they can be used for specific validation of transformation event in transgenic soybean GTS40－3－2.Further,we utilized the content of5%,2%,1%,0.5%and0.1%transgenic soy-bean GTS40－3－2as the sample to carry out PCR sensitivity validation,the results demonstrated the sensitivity of the five primers could reach0.1%.Finally,we selected out RRS2primer was the best primer for specific validation of transformation event in transgenic soybean GTS40－3－2by using fluorescent quantitative PCR in comparison with Ct values and the melting curves among five specific Primers.The results of this paper would provide a scien-基金项目：本研究由现代农业产业技术体系建设专项资金(nycytx－24)、国家948项目(2006－G37,2010－S19)、国家基金项目(310 70330)、国家“863”计划项目(2007AA100701)、福建省科技计划重点项目(2007I0036)、福建省自然科学基金项目(2009J05050)和福建科技项目备案(F2007AA100701)共同资助基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biologytific and reasonable experiment refference for validating the composition of genetic modified organisms in the fu-ture in our country.Keywords Transgenic soybean,GTS40－3－2,Transformation event,Specific PCR validation自从世界第一例转基因烟草1983年在美国问世以来，国际上已有三十多个国家批准了数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类达四十多种。

其中转基因大豆是世界上商品化最早、推广应用速度最快的转基因作物(余永亮等,2010)。

国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)2010年2月24日公布的年度报告显示，2009年全球转基因作物的种植面积达到了1.34亿ha，比2008年增长了7%，1996年至2009年间转基因作物种植面积空前增长了80倍，使转基因成为农业近代史上利用最快的作物技术。

其中转基因大豆种植面积占全球9000×104ha大豆的3/4，占转基因作物总种植面积的50%，分布国家从2个增至10个(James,2008)，在所有转基因作物中种植面积最大，是全球最重要的转基因作物(钟金传等,2005)。

中国作为WTO的成员国之一，已经从国外大量进口转基因大豆。

为了保护我国大豆种质资源安全，保证我国在进口大豆产品贸易过程中的利益，国务院颁布《农业转基因生物标识管理办法》等法律法规，要求实行转基因标识制度。

我国政府对转基因生物产品的标识制度为定性标识，即零阈值。

转基因标识制度能否被顺利执行，关键在是否有稳定、准确和高灵敏度的检测技术作保障(王恒波等,2008;李晓丹和王世平,2003,食品研究与开发,24(5):106-109)。

转基因检测通常是针对外源DNA和外源蛋白的检测，一是应用PCR和杂交法(徐景升,2004)；二是应用ELISA检测表达的外源蛋白。

PCR法能够高效地扩增低拷贝数的外源DNA，是核酸现行首选的检测方法。

针对PCR方法又分为筛选检测、基因特异性检测、结构特异性检测和转化体特异性检测(李飞武等,2009)。

李飞武等(2009)以lectin基因作为内参照基因建立了转基因大豆RR2Y转化体特异性定性PCR检测方法；李飞武等(2010)对转基因大豆MON 89788转化体特异性进行了定性PCR检测；袁磊等(2010)建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。

转化体特异性检测是以外源基因与植物基因组相连接区域为检测对象，这样连接区域对不同转基因株系都是其特异的，并且在基因组上是单拷贝，因此该类检测方法具有高度的特异性(李飞武等,2009)。

目前已经建立转化体特异性检测方法的转基因转化体包括MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MON513和MON1445 (Berdal and Holst-Jensen,2001;Christer et al.,2004; Hernández et al.,2003;2004;Huang and Pan,2004; Pan et al.,2006;Taverniers et al.,2005;Yang et al., 2005)等。

而推广面积较大的抗草甘膦大豆(GTS40－3－2)未见有品系特异性检测引物及相关检测标准，本文通过NCBI查找已公布该大豆的旁侧序列信息，设计5对特异性引物进行PCR验证检测，从引物的退火温度、特异性、灵敏度及引物与模板的结合优先性方面进行检测，筛选该品系大豆特异的PCR反应的最佳条件，从而建立转基因大豆GTS40－3－2品系特异性检测方法，为规范我国转基因标识制度提供强有力的技术支撑。

1结果与分析1.1基因组DNA质量分析高质量的基因组DNA是PCR检测的前提条件，核酸浓度与纯度测定的结果显示所有样品的A260/280均在2.0左右，说明所获得的DNA都比较纯，可进行进一步实验。

按照标准规定对物种的内源单拷贝基因进行PCR检测，可以判定提取的DNA是否适合进行PCR扩增，可以避免假阴性检测结果的出现，因此，通过扩增大豆的内源单拷贝Lectin基因，可以判断提取的大豆DNA是否符合PCR检测要求(图1)。