Received 2004-09-24 Accepted 2004-12-10*Corresponding author. Tel: +86-21-54237098; Fax: +86-21-54237098; E-mail: yczhu@血管内皮细胞和心脏组织块的立体培养王铭洁，蔡文杰，姚 泰，朱依纯*复旦大学上海医学院生理学与病理生理学系，上海 200032摘 要：本文旨在对比研究二维平面与三维立体培养模式下，内皮细胞和心脏组织形态学的差异。
采用胶内、胶上、三明治模式、玻片培养小室模型等多种Ⅰ型胶原立体培养模型，通过免疫荧光技术及显微形态学观察组织和细胞的生长情况。
在二维平面培养中，原代心脏血管内皮细胞呈铺路石样排列；而在三维胶原培养模式中，内皮细胞呈长梭状形态，并迁入胶原培养介质中，和体内血管新生及血管生成过程中的内皮细胞活化表型相似。
加入血管内皮生长因子(vascular endo-thelial growth factor, VEGF)能增强内皮细胞管状结构的形成。
在三维胶原中，心脏组织块生长良好，迁出的细胞将相邻组织块连接起来，组织块有自发的搏动。
本工作表明，改进的薄层胶原培养、玻片培养小室模型和动脉条模型是较好的研究血管生成和血管新生的工具。
在三维培养的情况下，内皮细胞通过空间增殖、迁移和锚定，可形成管状结构，比二维平面培养更适合用于血管新生的研究。
不同的立体培养模型可用于不同目的的研究。
关键词：血管新生；Ⅰ型胶原；内皮细胞；组织培养中图分类号：Q463; R33Endothelial cells and cardiac explants in three-dimensional culture systemWANG Ming-Jie, CAI Wen-Jie, YAO Tai, ZHU Yi-Chun *Department of Physiology and Pathophysiology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, ChinaAbstract: To observe the morphological features of endothelial cells and cardiac explants cultured in two- or three-dimensional culture systems, several three-dimensional collagen type Ⅰ culture systems, such as the in gel, on gel, sandwich model, and the microscope slide model, were used to examine the growth patterns of the cells and explants from heart by using immunofluorescence staining and microscopic observation in the presence or absence of vascular endothelial growth factor (VEGF). In two-dimensional cultures the primary cardiac endothelial cells arrayed into a cobblestone-like structure. When cultured in three-dimensional matrix, the cells were elongated and migrated into the gel, with a phenotype similar to that in the process of angiogenesis and vasculogenesis in vivo . VEGF promoted the process of the endothelial cells transforming into tube-like structure. Cardiac explants grew well in the collagen gel.Adjacent explants were connected to each other by the migrating cells with the occurrence of autorhythmic beating of the explants.Thin-layer collagen gel, microscope slide chamber and aorta-strip model were also tested and proved to be good tools for vasculogenesis or angiogenesis studies. Three-dimensional culture systems enable the endothelial cells to proliferate, migrate, and anchor to three-dimensional vascular structures, showing advantages for observing the feature of angiogenesis. Different three-dimensional culture models may be used for variable research purposes.Key words: neovascularization; collagen type Ⅰ；endothelial cells ；tissue culture由于缺血心脏组织中血管新生 (angiogenesis)和原有侧支循环的扩张往往不足以满足心脏对血供的需要，运用促血管新生因子增强缺血区血管新生的临床运用取得了很大进展。
但是，目前血管新生治疗尚存在不足，例如局部血管瘤的形成，有些个体中该疗法收效甚微。
因此需要对血管新生的过程和态跟踪此过程，而只能对某一时间点的胶原块经固定后制作电镜标本观察。
2000年首次报道的玻片培养小室模型[8]对胶上模型进行了改进，提供了一种能直接在光学显微镜下从内皮细胞单层侧面观察内皮细胞出芽过程的方法。
我们通过采用不同的立体培养方法培养内皮细胞和心脏组织块，阐明了立体培养和平面培养条件下细胞、组织形态学的差异。
我们还对立体培养方法进行了改进，使之能更好地模拟体内情况，同时又便于观察和统计，从而为以后的体外血管新生研究奠定方法学基础。
1 材料与方法1.1 主要药品 鼠尾Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,C7661，Sigma 公司)， 重组人源性VEGF (rhVEGF,V7259, Sigma 公司), DMEM 培养液(高糖型，Gibco 公司) , 胎牛血清(Gibco 公司) ,兔抗人八因子相关抗原多克隆抗体(A0082，Da ko 公司),小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体 (MCA1334G ，Serotec 公司)。
1.2 细胞培养与鉴定1.2.1 爬块法分离心脏血管内皮细胞[9] 取体重为80 g 左右的雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠两只，用1.5%戊巴比妥钠 0.3 ml/100 g 腹腔注射麻醉，浸泡于酒精中消毒皮肤。
无菌开胸取出心脏，漂洗清除血液后用小剪刀剪去心包膜、心房、右心室、室间隔、乳头肌及左心室外1/4部分。
将剩余的左室组织小心剪碎，在玻璃培养瓶内干涸培养30 min 后加入含20%胎牛血清的DMEM 培养液。
培养至72 h 时冲去组织块，更换新鲜培养液，继续孵育直至细胞融合。
本实验中使用的均为培养的第一代细胞。
1.2.2 心脏血管内皮细胞的鉴定(间接免疫荧光检测) 检测培养细胞的CD31、八因子相关抗原的表达。
在35 mm 培养皿中置无菌盖玻片，将原代培养至单层近融合的内皮细胞消化，接种于盖玻片上。
融合至(70~80)%左右时取出盖玻片，用PBS 洗三次，–20℃预冷的丙酮(100%)固定7 min ，干燥后用PBS 洗三次。
然后用10 %正常羊血清在37 ℃下孵育20 min ，封闭非特异性抗原结合位点。
加入一抗(兔抗人八因子相关抗原多克隆抗体、小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体)37 ℃孵育2 h(阴性对照只加血清)。
用含2%羊血清的PBS 洗涤三次，加入Rhodamine 标记的荧光素二抗(抗兔、抗小鼠IgG)，调控机制做进一步深入的研究，从而在临床应用中能更好地改善患者心肌缺血的状况。
由于血管新生过程受可溶性因子、内皮细胞和细胞外基质等多种因素的影响，在整体实验中不易对某特定因素进行研究，因此在体外模拟体内的血管新生，最大程度地重现该过程，成为研究中需要解决的一个重要技术问题。
完整的血管新生过程包括新血管的生成和新血管的稳定两个相继的步骤[1]。
经典的二维平面培养可用于研究内皮细胞的增殖、迁移、蛋白水解活性、内皮细胞的凋亡[2]以及平面管腔形成[3,4]等实验观察。
但是，由于二维平面培养不能提供给细胞类似体内血管新生过程的立体环境，对血管新生过程的观察有很大的局限性。
三维培养模型因能用于观察血管新生过程的更多方面，例如内皮细胞的出芽等，因而比二维培养有更多优点。
在三维培养模型中使用合适的三维基质，可使激活的内皮细胞长入三维基质,合适的三维基质包括胶原胶(collagen gel)、血凝块(pla sma clot)、纤维蛋白胶(fibrin gel)、基底膜基质复合物(matrigel)，或者以上几种蛋白质的混合物[2]。
Ⅰ型胶原在三维培养基质中使用最广泛。
Ⅰ型胶原是体内含量最多的细胞外基质蛋白，其酸性可溶成分被中和后，能在体外37℃温度下形成凝胶。
将细胞接种于其表面或其内部，可观察到细胞形态的变化和管状结构的形成过程。
因此这样的培养能模拟体内的血管新生过程。
和胶原相比，纤维蛋白胶容易受细胞分泌的蛋白水解酶的作用而发生降解，因此必须添加蛋白酶抑制剂，从而阻断因基质降解而引起的管腔结构退化[5]。
基底膜基质复合物价格昂贵，成分尚未完全明确，因此限制了其推广使用。
三维立体培养的方法有多种，常用的有胶内培养模式(细胞与胶原胶混合)、胶上培养模式(细胞生长于胶原胶表面)[6]和三明治培养模式(细胞生长于两层胶原中间)[7]。
胶内培养模式可用于观察血管生成(vasculogenesis)过程[6]，即模拟体内血管从无到有的过程。