中国修复重建外科杂志2011年2月第25卷第2期·139·

人脐静脉血管内皮细胞体外培养的方法研究

蔡维霞1Δ 梁亮2Δ 计鹏1 张万福1 张战凤1 张彦刚1 

肖西峰3 白晓智1 朱华宇1 胡大海1 韩骅2

【摘 要】 目的 建立人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）体外高效稳定培养的方法，为组织工程及相关医学基础研究提供稳定的细胞来源。 方法 取自愿捐赠足月妊娠分娩的新生儿脐带，用自制空针软管静脉注入0.1%Ⅱ型胶原酶，置于37℃培养箱中，消化收集，采用含5% FBS及1%内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor,ECGS）的内皮细胞专用培养基进行培养。将消化前后的脐带标本行HE染色，观察HUVECs脱壁情况；流式细胞仪检测原代细胞纯度；细胞培养期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态；取第3代HUVECs

行免疫细胞化学染色观察、MTT检测细胞增殖情况，并将细胞接种于细胞外基质胶Matrigel上培养24 h，观察细胞管腔形成情况。 结果 经Ⅱ型胶原酶消化后的脐带内HUVECs大量脱落，细胞消化完全。经Ⅱ型胶原酶37℃培养箱中消化15 min后，可获得纯度为 99.56% 的HUVECs；原代HUVECs培养后2～3 d生长最快，呈典型的铺路石或鹅卵石样排列，4～6 d融合成片。 MTT 法检测显示第3代HUVECs培养后3～4 d细胞生长最快，5 d 左右融合；免疫细胞化学染色显示内皮细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性，培养24 h后在细胞外基质胶Matrigel上可见类似于毛细血管的完整闭合管腔形成。 结论 经自制空针软管静脉注入0.1%Ⅱ型胶原酶，使静脉充分充盈，内皮消化完全，采用含5%FBS和1%ECGS的内皮细胞专用培养基，可迅速获取大量高纯度、高存活率的HUVECs。【关键词】 组织工程 种子细胞 人脐静脉血管内皮细胞 细胞培养 

EXPERIMENTAL STUDY ON CULTURE METHOD OF HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS/CAI Weixia1, LIANG Liang2, JI Peng2, ZHANG Wanfu2, ZHANG Zhanfeng1, ZHANG Yangang1, XIAO Xifeng3, BAI Xiaozhi1, ZHU Huayu1, HU Dahai1, HAN Hua2. 1Burns Center of Chinese PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an Shaanxi, 710032, P.R.China; 2Department of Medical Genetics and Developmental Biology, the Fourth Military Medical University; 3Department of Gynecology and Obstetrics, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University. Corresponding author: HAN

Hua, E-mail: huahan@fmmu.edu.cn; HU Dahai, E-mail: burns@fmmu.edu.cn 【Abstract】 Objective To establish an efficient and stable culture method of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro so as to provide good source of seed cells for tissue engineered vascular grafts and for preclinical research. Methods The umbilical cords were harvested from full-term normal delivered neonates, which were perfused with 0.1% collagenase II by self-made needle and were digested at 37 and 5% CO2 humidified incubator. The HUVECs were cultured in endothelial culture medium (ECM) containing 5% fetal bovine serum (FBS) and 1% endothelial cell growth factor (ECGS). HE staining of the umbilical cords before and after digestion was used to observe the detachment of HUVECs, flow cytometry to detect the purity of primary HUVECs, and inverted phase contrast microscope to observe the morphology of the cultured HUVECs. The growth of the 3rd passage cells was measured by MTT assay; immunocytochemical technique and matrigel-based capillary-like tube formation assay were carried out to identify the function of HUVECs. Results After digestion of 0.1% collagenase II, marked HUVECs detachment was observed with complete digestion. The purity of the HUVECs was 99.56% by digestion of 0.1% collagenase II at 37 and 5% CO2 humidified incubator for 15 minutes. Primary HUVECs showed a cobblestone or pitching stone-like appearance in vitro, forming a confluent monolayer cells after 2-3 days of culture. MTT assay demonstrated that HUVECs showed the fastest growth speed at 3 to 4 days, and showed growth of cell fusion at about 5 days. Immunocytochemistry showed that HUVECs highly expressed endothelial marker factor VIII. Matrigel based capillary-like tube formation assay showed that it could form endothelial-like tube structures after 24 hours of culture. Conclusion Using improved method and ECM could obtain high quantity and high quality primary HUVECs, which might be a kind of promising seed cells for tissue engineering and preclinical research.

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作者单位：1 第四军医大学西京医院全军烧伤中心（西安，710032）；2 第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室；3 第四军医大学唐都医院妇产科△为共同第一作者

通讯作者：韩骅，教授，博士生导师，研究方向：血管发生的分子机制，E-mail: huahan@fmmu.edu.cn；胡大海，教授，博士生导师，研究方向：创面愈合与组织修复，E-mail: burns@fmmu.edu.cn网络出版时间：2011-1-6 16:22:41；网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1372.R.20110106.1622.201102.6_001.html

℃Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, February 2011, Vol. 25, No.2·140·

【Key words】 Tissue engineering Seed cells Human umbilical vein endothelial cells Cell culture

血管内皮细胞具有多种生理功能，可产生和分泌多种生物活性物质，参与机体正常调节，也可因周围环境改变造成功能紊乱。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细胞功能及其在各种疾病的发生、发展中所起作用的基础。人脐静脉作为内皮细胞的来源，具有取材容易、来源较充足以及操作简便的特点，同时体外获得的人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）混杂细胞较少，与各种实验动物来源的血管内皮细胞比较，更接近人体内皮细胞生长特点，因此由人脐静脉分离培养的HUVECs是体外研究常用血管内皮细胞之一[1]。目前，关于HUVECs培养方法的报道较多，但还存在一些问题，如细胞消化不彻底、阳性率低、不能反复传代等[2-5]。基于大量HUVECs 培养经验，本实验建立并改良了一套操作性较强、成功率较高以及细胞生长状态佳的HUVECs分离和培养方法。报告如下。1 材料与方法1.1 实验材料及主要试剂、仪器足月妊娠分娩的新生儿脐带10根（离体时间< 3 h），均由第四军医大学唐都医院妇产科产妇自愿捐赠且知情同意。排除早产、妊娠高血压综合征、羊水Ⅲ度污染及产妇伴感染性疾病等。Ⅱ型胶原酶（Sigma 公司，美国）；内皮细胞专用培养基（Sciencell 公司，美国）；兔抗人Ⅷ因子抗原多克隆抗体、免疫组织化学染色试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司）；细胞外基质胶Matrigel（BD公司，美国）；APC标记抗人CD31 抗体（Bioscience 公司，美国）。荧光倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；BHC- 1300ⅡA/B型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司）；Model 680型酶标仪（Bio-Rad公司，美国）；CO2 培养箱（Thermo 公司，美国）；高速低温冷冻离心机（Heraeus 公司，德国）；自制空针软管（将一次性静脉输液针保留前端软管套，另一端连于20 mL注射器）。1.2 HUVECs分离培养1.2.1 原代培养 ①表面消毒：于取脐带3 h内进行细胞培养。将脐带置于0.25%洗必泰溶液浸泡10 min，无菌生理盐水冲洗3次，去除脐带外周残留血，剪去有血肿、钳痕以及较弯曲部分，选择一段长约20 cm较直的脐带，修剪两端齐平备用。另剪取长约1 cm脐带，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片后，HE染色，倒置相差显微镜下观察。②管腔冲洗：从备用的脐带一端找到脐静脉后，将自制空针软管一端插入静脉内，用含肝素的生理盐水反复冲洗脐静脉至流出液清亮无色为止。③消化细胞：将脐带两端抬起成U形，一端通过自制空针软管将约10 mL预热的0.1% Ⅱ型胶原酶注入脐静脉，直到气体排尽、管腔完全充盈且另一端有Ⅱ型胶原酶流出时，用止血钳回折后夹住两端，置于37℃预热的PBS缓冲液中，于37℃、5%CO2