2、溶液的pH值 pH对显色剂的平衡浓度、被测组分的存在形 态以及配合物的形成起了重要作用。适当调节 pH或使用缓冲溶液还可以消除某些干扰反应。
在被测组分浓度和显色剂浓度一定的条件下，
做pH—A曲线，当吸光度基本不变的某pH范围
即为适宜的pH范围。
A
1.0
0.5
2
4
6
8
pH
溶液pH与吸光度关系曲线
电磁辐射按波长顺序排列所画成的图表称为电磁波谱。 紫外及可见光区在整个电磁波谱区内仅占很小的一部分。

波谱区
近紫外
波长范围 nm
200-400
光子能量ev
6.2-3.1
跃迁能级类型
分子电子能级
可 见
400-750
3.1-1.7
二、物质对光的吸收
当光通过透明物质时，其中某些波长的光会被 选择性地吸收而使透射光强度减弱，则物质对 光产生吸收作用。
卫生分析中常用的分析方法。
一、电磁辐射的性质

电磁辐射(Electromagnetic radiation)是一种以巨 大速度（在真空中为2.9979×1010cm/s）通过空 间传播的能量，最小单位是光子。它具有波粒 二象性，既具有粒子的性质，也具有波动的性
质。
（一）波动性和微粒性

就波动性而言，其特征是每个光子具有一定的波长。 在一定的介质中，它们之间消除
一、偏离吸收定律所引起的误差 二、光度误差 三、仪器误差 四、与显色反应有关的误差 五、参比溶液
一、偏离吸收定律所引起的误差 （一）化学因素
1、溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合、 与溶剂之间的作用等等原因而发生偏离吸收定 律的现象。 2、一些物质能产生荧光，由于荧光进入检测器，
（二）显色条件
1、显色剂浓度 显色剂太多或太少都会引起偏离比尔定律。 在显色反应时，加入显色剂的量，必须是过 量、适量和定量的。
一般加入显色剂和其它试剂的量是通过实验
来确定的。建立一个新的实验方法必须做显色
剂用量与溶液吸光度关系曲线。
A
1.0
0.5
0.5 1
2
3
4
Vml
显色剂用量与吸光度关系曲线
二、类型
紫外-可见分光光度计分为单波长和双波长 分光光度计两类。单波长分光光度计又分为单 光束和双光束分光光度计。新型的分光光度计 有多通道分光光度计。
第四节 分光光度法的定性和定量
一、定性方法 根据被测物及标准物的

吸收曲线的形状是否相似； λmax、λmin及λsh是否相同； 是否相同进行定性分析。
二、定量方法 （一）单一物质的定量 1、标准曲线法： A abC 定量依据： 2、比较法： 在相同条件下测定Cs的As与Cx的Ax As abCs 由 Cs AX AX abC X CX 得 As （二）混合物的定量 混合物的定量分析就是利用吸光度的可加性 原理，通过解联立方程式来进行计算。

第三节 分光光度计主要部件和类型

用于研究与波长有关的光的发射、吸收或荧光 的仪器，称为光谱仪或分光光度计。 构成分光光度计的各基本单元相似，一般包括 五个基本单元：（1）光源(source)；（2）单色 器(monochromator)；（3）吸收池(absorption cells) ；（4）检测器（或传感器）(detector)； （5）读出装置或显示系统(display system)。
E电子是分子中电子相对于原子核运动所具有的能量； E振动是分子内原子在平衡位置附近振动所具有的能量； E转动是分子绕着重心转动所具有的能量。
发生电子能级间跃迁需要的能量约为1-20ev，相应的波长 为1230-62nm。由电子跃迁产生的分子吸收光谱称为紫外-可见
吸收光谱或电子光谱。 发生分子振动能级间跃迁需要的能量较小，一般在0.0251ev之间，相应的波长约为50-1m，它属于红外光区。由此产 生的分子吸收光谱称为红外吸收光谱或振动-转动光谱。 发生分子转动能级间跃迁需要的能量更小，约为0.0040.025ev之间，相应的波长约为50-300m，属于远红外光区。这 种分子吸收光谱称为远红外吸收光谱或转动光谱。


紫外-可见分光光度法、原子吸收分光光度法、 红外吸收光谱法就是根据物质对光的吸收特性 而建立的定性、定量分析方法。
分子中有原子与电子，分子、原子、电子都是运动 着的物质，都具有能量。分子和原子一样，它具有特 征的分子能级。 分子的总能量由以下几部分组成：
E总 E电子 E振动 E转动
（2）多道光子检测器：是将小的光电敏感单元的 一组阵列以线性或以两维模式排列在一只含有电子线 路的单片硅半导体芯片上，该芯片能将每个光电敏感 单元的电信号直接输出，并同时检测。 多道光子检测器的特点是快速，一次可同时测量 较宽的光谱范围。常用的有光二极管阵列检测器 (photo-diodearray detetor)。
第二章 紫外-可见分光光度法 ultraviolet-visible spectrophotometry 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 概述 光的吸收定律 分光光度计的主要部件和类型 分光光度法的定性和定量 分光光度法的误差来源及其消除 提高分析灵敏度和准确度的方法 样品处理及分离
可导致透光率增大，引起误差。
3、吸收定律只有在描述稀溶液时才是成功的。
（二）非单色器的影响

吸收定律的一个重要前提是单色光，即只有一种 波长的光。多色光可以使吸光度变值而偏离吸收
定律。其主要原因是同一物质对不同波长的光有
不同的吸光系数。

消除方法是：① 改进仪器性能，增加抗光谱干扰 能力。②采用掩蔽剂，加入一种能与干扰离子选 择性形成较稳定的无色络合物或与分析物具有不 同的吸收光谱的试剂。

四、与显色反应有关的误差
（一）显色反应和显色剂

在许多情况下，样品中的被测组分不产生吸收， 必须加入另一种试剂（显色剂），使该试剂与 被测组分作用形成有色化合物。 选择合适的显色剂是关键。原则是： ① 灵敏度高。

② 选择性好，通常是根据试样组分选择干扰少 或干扰容易消除的显色反应。
③ 生成的有色物质的稳定性大，颜色稳定且有 确定的组成。
3、显色时间 由于各显色反应的速率以及形成有色化合物 的稳定性不同，因此必须控制显色时间。 4、显色温度 通常，显色反应在室温下进行，但有的反应 需要升温或降温。
5、共存离子的影响

共存离子本身有颜色，或者能与显色剂发生反应生 成有色络合物，使测定结果偏高。 共存离子与显色剂或被测组分发生络合反应或氧化 还原反应，降低显色剂或被测组分的浓度阻碍显色 反应的完成，使测定结果偏低。 在测定条件下，共存离子发生沉淀，影响吸光度的 测定。
当一束平行单色光通过一个一定厚度的含有吸光 物质的物体时，一些光子被吸收，光的强度会 降低。
I0
I
c
b

朗伯—比尔定律是吸收光度法的基本定律。 ①朗伯定律说明吸收与厚度间的关系；

②比尔定律说明吸收与浓度的关系。
I lg abC I0
数学表达式为：
透光率 T transmittance：即透射光强度 I与入射光
C /
式中C是电磁辐射在真空中的传播速度。

就辐射的粒子性而言，其主要特征是每个光子具有能量E， 其与频率及波长的关系为
E h h C /
式中h是普朗克常数 Planck constant，其值为6.63×10-34 J/S。
（二）电磁波谱(Electromagnetic spectrum)

三、吸收光谱（absorption spectrum）

以波长为横座标，以吸光度为纵座标，描绘的图谱 即为吸收光谱或吸收曲线（ absorption curve）。
吸收光谱上，一般都有一些特征值。

吸收曲线的特征以及整个光谱的形状是定性鉴别的 依据之一。 吸收光谱的λmax，是物质定量时的测定波长，因为 在此处测定的灵敏度最高。
二、吸光系数(absorptivity)

吸收定律中的a称为吸光系数，即单位吸收层厚度、单位浓 度的吸光度。其在给定条件下单色光波长、溶剂、温度等， 吸光系数是物质的特征常数。 在吸光度与浓度之间的直线关系中，吸光系数是斜率，是 定量的依据，其值越大，灵敏度越高。

比吸光系数A 1%1cm ：当不知道物质的分子量时用此来表示 吸光能力的大小。 摩尔吸光系数(molar absorptivity)：其意义是溶液中吸光物 质浓度为1mol/L，吸收层厚度为1cm时的吸光度。
（三） absorption cells

盛放试样的吸收池（也称比色皿、样品池）由
透明的材料制成。在紫外光区工作时采用石英
材料；可见光区则用硅酸盐玻璃。 吸收池的形状有方型、圆柱型等，其光程长 度有0.5cm、1cm、2cm、3cm、10cm等。
（四） detector

检测器将光能转变为电信号。 分为两类：单道光子检测器和多道光子检测器。 （1）单道光子检测器：以真空光电二极管或光电倍 增管（photo multiplier PMT）为检测器。 紫敏光电管采用锑-铯（Cs3Sb）光电阴极，光谱响 应范围为200-625nm； 红敏光电管采用银-氧-铯（Ag-O-Cs）光电阴极，光 谱响应范围为625-1000nm。
二、光度误差

通常将吸光度控制在0.1—1.0范围内。 消除误差常用的方法是：
① 当待测物含量高时，少取样品或稀释试液；含 量低时，多取样品或预先用适当方法富集。 ② 选择适当厚度的吸收池，以调节A读数。
三、仪器误差
常见的是仪器的光源不稳定。 吸收池的厚度不一致或污染。 消除的方法是：① 测定前仪器先预热，使光源 尽量稳定。②选择配套的比色皿。③ 比色皿应 清洗干净。