董慧
什么是乳酸菌？细菌素？
• 乳酸菌是一类能够发酵糖类产生大量乳酸 的革兰氏阳性菌耐氧或碱性厌氧菌。包括 主要包括乳杆菌(Lactobacillus )、乳 球 菌 ( Lactococcus )、明 串 珠 菌 ( Leuconostoc )、 片 球 菌 ( Pediococcus )、 链 球 菌(Streptococcus )、肠 球 菌 ( E nterococcus )、双 歧 杆 菌 (Bifidobacterium )等至少23个属。
嗜酸乳杆菌11088的细菌素基因
• lactacin F
laf
ORFX ORFY ORFZ
75
32 62 124
后三个读码框可能与细菌素的表达分泌 有关，有待研究。 利用穿梭载体将该接合质粒上一段包含 lactacin F 结构和免疫基因在内的 212kb 的DNA 片段克隆、 导入不产 lactacin 的同源乳杆菌中, 表达成功
• nisin 的结构基因(nis A )位于染色体的可接 合转座子上, 转座子大小为70kb, 其中在 10kb的片段上分布着 nis A、 B、 T、 C、 Z、 P 和K 基因, 构成一个长度约为815kb 的多顺反操纵子, 其中5′ - 端有一个核糖体 结合位点, 3′ - 端有一个终止密码子和不依 赖于ρ因子的转录终止子; 多顺反子mRNA 含有RNA 修饰、 加工信息, 加工后产生一 个267kb 的mRNA 转录产物。
两种细菌素对脂质体无效进一步证实其抑菌 作用依赖于膜上特定受体蛋白。携有 lactococcin A 和lactococcin B 免疫基因的细 胞能对这两种细菌素产生抗性,推测免疫蛋白 可能就定位于细胞膜上。 免疫蛋白与细胞膜 表面特定受体蛋白的靶位点结合后, 使该受 体蛋白不能再介导细菌素在细菌细胞膜上形 成亲水孔道, 致使细菌对细菌素产 生抗性。 简言之, 细菌素免疫蛋白的存在抑制了膜上 亲水孔道的形成。
定此三种细菌素生物学功能上的变异并非 源于转录水平的
研究表明, 大量分泌蛋白前体的信号肽序列 都有一个保守的三联结构: 一个带正电荷的 N - 端区域, 一个中央疏水区域和一个极性 的C- 端区域, 三个区的长度分别为 1～5、 7～ 15 和3～ 6 个残基, 其中C- 末端为信号 肽酶的识别位点, 其模式为XXA (G)↓(X 为任 意一种氨基酸, ↓为酶切位点）
• helveticin J 是由 lactobacillus helveticus (瑞士乳杆菌)481 产生的一个染色体编码的 37kDa 的细菌素, 抑菌谱较窄, 仅对一些同 源乳杆菌有效
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1-启动子
2-反向重复序列，可能与调控有关
3-核糖体结合区域
4-开放读码框ORF2，315bp , 编码一个 1118kDa 的未知功能蛋白
• 许多乳酸菌能够产生具有杀菌或抑菌作用 的细菌素。
• 细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核 糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的 多肽或前体多肽, 抑菌范围不仅仅局限于同 源的细菌, 产生菌对其细菌素有自身免疫性。
1、乳酸菌细菌素的分类
基于分子量、 热敏感性和是否含修饰性氨 基酸, 可将乳酸菌细菌素大致分为四类: • 小分子热稳定肽( small heat- stable peptide, SHSP) • 大分子热不稳定蛋白( largeheat - labile p ro tein, LHL P ) • 羊 毛 硫 抗 生 素( lantibiotics) • 赖于两个或两个以上小肽分子协同作用的 细菌素
2.3转运机制
• 分析SHSP 的N - 端先导序列发现并没有典 型的信号肽结构, 除 lactacin F 外, 其它 SHSP 的N - 端先导序列中缺乏分泌蛋白信 号肽所共有的中央疏水区, 其前导序列较短, 且含有数个酸性氨基酸残基。由此提示 SHSP 中可能存在一种新型的转运机制
• 由前面讨论可知,WM 4 的 lactococcin A 结 构基因上游的 lcn C、 lcn D 基因可能参与 细菌素表达及分泌
质粒编码细菌素的遗传图谱
• lactococcin A
lcnA
lciA
75
98
• lactococcin B
lcnB
lciB
68
91
• lactococcin M
lcnM
lcnM/b
lciM
69
77
154
乳脂乳球菌 9B4 产生的 lactococcin A、 B 和 M , 其结构( lcn)与免疫( lci)基因均定位于一个 60kb 大小的接合质粒(P9B4- 6)上。
2.4作用机制
• 发现纯品 lactococcin A 能够增加敏感株的 膜通透性, 导致膜电势崩溃, 使胞内和膜质 体内的氨基酸、 ATP 等营养物质外流, 但对 脂质体无效
lactococcin 在细胞膜上形成亲水性通透孔 道是经膜上特定受体蛋白介导, 与膜电位无 关, 因此又称这类细菌素为非能量依赖型细 菌素, 其作用主要是破坏膜功能的稳定性(如 能量转导)。
5-开放读码框ORF3，999bp，结构基因
6-ρ- 终止子
4、羊毛硫抗生素( lantibiotics)
• lantibiotics 的显著特点是分子内含有非编码 氨基酸, 包括羊毛硫氨酸、 B - 甲基羊毛硫 氨酸、 脱氢丙氨酸(DHa)和脱氢丁氨酸 (DHb )。非编码氨基酸的存在侧面提示了 lantibiotics 在形成过程中必定经过了翻译后 的酶修饰与加工。
环形分子lactocin S
• 分子中有 2 个羊毛硫氨酸, 3 个Dha 和 1个 DHb
• lactocin S 的结构及免疫基因定位在粟酒乳 杆菌L 45 的一个50kb 质粒上, 负责 lactocin S 前体肽翻译后修饰及跨膜转运的基因也都 位于同一质粒上
2、小分子热稳定肽(SHSP)
• 2.1遗传学分析 • 2.2结构上的共性 • 2.3转运机制 • 2.4作用机制
2.1、遗传学分析
对乳酸菌细菌素的分子遗传学研究表明许 多细菌素的产生与质粒相关。下面分析六 种质粒编码细菌素的遗传图谱,对于每一种 细菌素, 其结构基因总是与两个或多个相关 基因紧密排列构成一个类操纵子结构模块。
明串珠菌的细菌素基因
• leucocin A - UAL 187
leuA 58-61
ORF2 113
• pediocin PA - 1
ORF2可能负责 免疫性
pedA 62
pedB 112
pedC 174
pedD 724
将此操纵子在重组质粒中克隆并导入E.co li表达, 则产 生并分泌出了有生物活性的pediocin ped编码的724个氨基酸的蛋白，参与运输与传递。
nisin的作用机制
• nisin 是一个疏水的带正电荷的小肽, 其作用 机制与其它 lantibiotics 相似, 作用靶位点是 细菌细胞膜。在一定膜电位存在的条件下, nisin 与细菌细胞膜结合形成通透性孔道结 构, 使A TP、 K+等小分子和离子通过孔道 流失, 造成细胞膜渗漏和去极化, 膜内外能 差消失, 因其作用需膜电位的存在, 故又称 为能量依赖性细菌素。
• 根据 lantibiotics 的分子结构可将其细分为 两类: 一类是线型的, 另一类是环型的。
线性分子nisin
• nisin 前体肽由57个氨基酸组成, 其中N - 端 23 个残基构成信号肽区; 信号肽在 细胞表面被信号肽酶水解去除后, 释放 出成熟的、 有生物活性的nisin。
• nisin 是一种含 34 个氨基酸的小肽, 分 子量约为3500Da, 分子内不含芳香氨 基酸, 但含有DHa、 DHb、 羊毛硫氨 酸和 B - 甲基羊毛硫氨酸。
2.2结构上的共性
• N - 末端信号肽长度均为 18～ 21 氨基酸 • 前体肽的起始氨基酸为Met, 紧随其后的氨
基酸残基通常为Lys残基 • N - 末端信号肽的- 1 和- 2 位置上为两个
Gly 残基 • 成熟的细菌素其N - 末端+ 1 位置上通常是
Lys 或Arg 残基
L actococcin A、 B、 M 的N - 末端信号肽 呈现高度同源, 提示其操纵子结构可能受同 一类启动子调控,而信号肽酶切位点 G—G 后的氨基酸序列则无明显类似性, 基于启动 子和N - 末端信号肽的高度同源性, 可以确
对乳酸乳球菌双乙酰亚种WM 4 的 lactococcin A 操纵子的研究结果证实该细 菌素的结构与免疫基因位于一个 136kb 的 质粒(pN P2)上, 序列分析表明这两个基因 与 9B4 的 lactococcin A 的结构与免疫基因 相同。值得一提的是,WM 4 的 lactococcin A 操纵子结构中除 lcn A 和 lciA 基因外, 其 上游还含有 lcn C 和lcn D 基因,在 lactococcin A 的表达及分泌中起重要作用
• lcn C 和 lcn D 基因与G-菌中负责蛋白分泌 的基因高度同源
研究发现 I L 1403 染色体上部分序列与WM 4 的 lactococcin A 基因簇序列高度同源, 提 示I L 1403 染色体上可能含有类似于 lcn C、 lcn D 的基因。 由此,将携有 lactococcin A 结构和免疫基因的穿梭质粒导入I L 1403, 借助 I L 1403 染色体上相应 lcn C 和 lcn D 基因的互补作用, 就可以合成有生物活性的 lactococcin A。
二级结构预测显示 lactacin F 分子N - 端有 一段 A - 螺旋, 信号肽酶切位点处则有一个 B - 转角
值得一提的是, lactococcin A、 B 和M 的前 体肽- 3 位置上均为Asn 残基, 这在其它分 泌蛋白前体的信号肽中极为罕见。Holo等 人认为 lactococcin A 的成熟过程是两步行 为: 信号肽酶首先水解 Gly- Gly 之间的肽键, 移去前体细菌素N - 端 20 个氨基酸大小的 信号肽, 然后再水解去除剩余肽段的N - 端 Gly 残基, 最后形成一个 54 氨基酸大小的 成熟细菌素