天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2009,21:101121014文章编号:100126880(2009)0621011204 收稿日期:2009202216 接受日期:2009206202 基金项目:西北民族大学校级中青年项目(XBMU 220062BD 282)3通讯作者Tel:862931229383112609;E 2mail:li m ingsheng@xb mu .edu .cn胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究李明生13,李 倬1,乔自林1,冯若飞1,马忠仁1,冯玉萍1,侯兰新1,张福梅21西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室;2西北民族大学理科实验中心,兰州730030摘 要:无菌采集健康牛胰脏,用0.125mol/L 的硫酸对牛胰脏进行预处理和保存,并对原材料的细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子进行检测,筛选合格原料。
通过盐析、C M 2Sephar ose 2FF 层析、超滤等方法对胰蛋白酶进行提取和纯化。
结果表明:经筛选原料提纯的胰蛋白酶通过细胞传代实验240h 后,细胞生长良好,形态正常,而未经筛选直接提取的胰蛋白酶通过细胞传代实验144h 后,细胞出现拉丝、病变等异常情况。
关键词:胰蛋白酶;原料;控制中图分类号:Q814.1;Q814.9;R285文献标识码:APrepara ti on and Trypsi n i n Cell Culture Appli ed ResearchL IM ing 2sheng 13,L I Zhuo 1,Q I A O Zi 2lin 1,FE NG Ruo 2fei 1,MA Zhong 2ren 1,FE NG Yu 2p ing 1,HOU Lan 2xin 1,ZHANG Fu 2mei21Key B io 2engineering &Technology L aboratory of S tate Ethnic A ffairs Co mm ission of N orthw est U niversity for N ationalities ;2Science Experi m ent Center of N orthw est U niversity for N ationalities,L anzhou 730030,ChinaAbstract:A sep tic acquisiti on healthy cattle pancreas,with 0.125mol/L sulfate of bovine pancreas p r ocessing and p res 2ervati on,and the ra w material of bacteria,fungi,endot oxin,Mycop las ma,phage and s ome virus detecti on of exogenous fact ors,screening qualified ra w materials .Thr ough salting 2out,FF 2C M 2Sephar ose chr omat ography,ultrafiltrati on method of tryp sin t o extract and purify,the results showed that the selecti on of ra w materials thr ough the purificati on of tryp sin and experi m ental cells 240h (5generati ons ),the cell gr owth good,nor malmor phol ogy,and without screening tryp sin di 2rectly fr om the cells thr ough the experi m ental 144h,the cells were drawing lesi ons such as abnor mal .Key words:tryp sin;ra w materials;contr ol 胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶,广泛存在于动物的胰脏,是一些生物制药的主要原辅材料。
随着生物制药的不断发展,因胰蛋白酶质量问题造成生物制药的质量安全问题也越来越引起人们的关注。
目前,胰蛋白酶在细胞工程方面的应用主要体现在疫苗的生产与研究,最终产品直接或间接的用于人体,因此,胰蛋白酶的质量好坏直接关系到人类的健康,甚至生命安全。
要控制好胰蛋白酶的质量安全,对原材料的把关是关键,由于胰蛋白酶来源于生物体,其成分复杂,单靠检验标准很难达到质量安全。
一旦由胰蛋白酶途经带入,会大大影响到细胞培养,甚至影响到疫苗的产量和质量。
国内对细胞培养用胰蛋白酶制备尚不成熟,且大都对原材料没有进行严格的筛选,质量控制的研究内容也不够全面。
本实验选择健康的牛源,在无菌环境下进行采集牛胰脏;采用合理、有效、安全的方法对原材料进行处理和保存,并对采集的原料进行细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子的检测,通过检验筛选合格的原料,为后续的胰蛋白酶提取工艺和质量控制提供保障。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 主要材料试剂牛胰脏、实验用所有细胞、实验用所有培养基(均由兰州民海生物工程有限公司提供)、N 2苯甲酰2L 2精氨酸乙酯盐酸盐(上海如吉科技发展有限公司)、胰蛋白酶1:250(Hycl one )、鲎试剂(湛江,安度斯)1.1.2 主要设备超滤仪(M illi pore,型号:XX8200230);层析装置(上海嘉鹏科技有限公司);;紫外/可见分光光度计(美国The mer,bi omate5);倒置相差显微镜(CK402 32PH,日本O ly mpus);生物安全柜(A3/B3,新加坡);层析柜(RE VCO;美国)1.1.3 对照品及菌种溶血性链球菌(S treptococcus he m olyticus)C M2 CC32210、白色念珠菌(Candida albicans) AT CC10231、大肠杆菌C3000(E.coli,中检所提供)、BVDV O regon C24V标准株(中国兽药监察所提供)、肺炎支原体(M.pneum oniae)ATCC15531、人型支原体(M.ho m inis)AT CC23714(上海汉尼生物有限公司);支原体、BVDV病毒外源因子、内毒素、噬菌体阴性血清(兰州民海生物工程有限公司提供)。
1.2 方法1.2.1 牛胰脏采集从牛颈动脉无菌采血致死,迅速去头剥皮后,将其移至层流罩下,开腹,无菌取出胰脏,去脂肪、结缔组织等,浸入预冷的0.125mol/L硫酸中,保存约30 m in,从酸中取出,绞成胰浆,按照《药典》2005版附录Ⅺ2J[1],取样约10g,其余迅速冷冻保存,同法采集5份,备用。
再以普通环境下采集牛胰脏,不浸入预冷的硫酸中,同法采集5份,备用。
1.2.2 原材料筛选将上述取样样品分别在无菌环境下研磨,并加入无菌生理盐水100mL,混匀,500r/m in离心5 m in,取全部上清后进行以下实验。
1.2.2.1 无菌检查依据《中华人民共和国药典》附录Ⅶ2A无菌检查法[1]。
1.2.2.2 细菌内毒素检查根据《中华人民共和国药典》附录Ⅻ2E,细菌内毒素检查方法[1]。
1.2.2.3 病毒外源因子2BVDV检测依据《中华人民共和国药典》细胞病变法[1]。
1.2.2.4 支原体检测依据《中华人民共和国药典》附录Ⅶ2A支原体检查法2培养法[1]。
1.2.2.5 大肠杆菌噬菌体检查取8mL胆盐乳糖增菌培养基加入1mL C3000菌液再加入2mL待检品,塞紧管口,置37℃振荡培养18h。
将无菌琼脂培养基在60℃水浴中完全溶化,取适量加入90mm培养皿中,备用。
铺板点样:取l mL大肠杆菌C3000菌液,加8mL 胆盐乳糖增菌培养基,混均,取适量加入(2)中备好的培养皿中,铺匀,将多余的菌液吸出,自然晾干置37℃恒温培养l h。
将(1)中经18h培养好的待检品经0.22μm过滤后点样,自然干燥后,置37℃恒温培养8h后判定结果。
待检样品如有噬菌体污染则出现噬菌斑,即判为阳性(+),反之判为阴性(2)。
1.2.3 胰蛋白酶原粗品的制备[2]1.2.4 胰蛋白酶原的活化[2]1.2.5 C M2sephar ose2FF离子交换层析取200mL C M2sephar ose2FF用蒸馏水将其保护液洗净即可。
其余方法参照文献[3]进行。
1.2.6 超滤浓缩纯化将层析液用蒸馏水40倍稀释,并参考文献[4],进行低压超滤。
2 结果2.1 胰蛋白酶原料微生物检查结果表1 胰蛋白酶原料微生物检查结果Table1 Result of sterility test on ra w meterial经无菌操作和硫酸处理样品Sa mp le are asep tic and p r ocessed by sulfuric acid普通操作未经硫酸处理样品None p r ocessing with sulfuric acid1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#阳性对照Positivecontr ol阴性对照Negativecontr ol无菌-----++++++-病毒外源因子-----±-+--+ -支原体------+--±+ -噬菌体-----++++++ - 注:“+”代表阳性,“-”代表阴性,“±”代表可疑。
Exp lanati on:+:Positive,-:Negative,±:Bet w een Positive and Negative.2101天然产物研究与开发 Vol1212.2 胰蛋白酶原料内毒素检查结果表2 胰蛋白酶原料内毒素检查结果Table2 Tryp sin ra w materials endot oxin test results内毒素含量(EU) Endot oxincontent经无菌操作和硫酸处理样品Sa mp le are asep tic and p r ocessed by sulfuric acid普通操作未经硫酸处理样品None p r ocessing with sulfuric acid1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#阳性对照Positive contr ol阴性对照Negative contr o<5+--+-++++++-5～10---+-++++++-10～50-----++++++-50～100-----++++-+-100～200------+++-+->200------++--+- 注:“+”,“-”代表内毒素含量在该范围内为阳性或阴性。