• 对于特别少的样本，容易显得杂质比较多
• 尽量将分选后细胞的洗涤过程减少到1次，并丐休 整数小时后再进行培养或是后续处理
分选后回测
仪器的维护保养
1、开液流和高压预热>30分 2、定期更换鞘液滤器（一年一次） 3、分选前检查Nozzle和O-ring
4、及时清洗放置Nozzle的部位和Nozzle Locking Lever
Tips: 如何提升活力
• 无菌环境的控制
• 降低鞘液压力 • 增大喷嘴孔径，脆弱细胞必须要用大孔径喷嘴
• 包被样本收集管
• 温度控制
• 提升速度
流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
鞘液
• 必须使用盐离子缓冲溶液作为 鞘液，通常是PBS，不建议使 用生理盐水 • 特别需要维持合适的pH值， 通常为中性 • 无菌分选时，需要高压灭菌鞘 液（建议一直使用无菌鞘液） • 一般不加NaN3 • 注意更换鞘液过滤器
合适样本类型
• 细胞大小一般不超过喷嘴孔径 1/5，绝不能超过1/3 • 建议无菌样本，容易维持上样针 部分的无菌条件
• 减少有高浓度PI的样本，以克残 留在管路内，影响后续样本活性
• 浓度可在107/ml • 一定要使用300-400目孔径过滤 网过滤
分选前
• 建议先进行预实验，调整实验设置，并丐预估回 收率，选择合适的样本量
PSI Hz μm events/sec
分选最重要的问题
• Good Purity – 分选后所得到的细胞是否是想要的？ • Good Recovery – 分选后得到的细胞数量是否够用? • Good Viability – 分选后有多少细胞是活的？
Aria III — 高纯度 高得率
Sweet spot - 液滴断点自动监控 Accudrop - 液滴延迟自动调节 32等分液滴分辨率，精确分选模式
分选中
• 温度的改变对细胞不利，控制上样舱和收集 的温度
• 一些细胞需要特别的培养基或是血清来维持 活性，加入不超过2%的血清 • pH值的变化同样会对细胞活性有影响，加入 不超过25 mM的HEPES到收集管中有助于维 持pH • 样本的沉降容易导致速度的降低和细胞的聚 集，导致堵塞，样本分选前过滤，可使用混 匀功能或上样管过滤器，减少此类事件发生
收集
• 收集管预先用human AB serum包被，然后加入 0.4 mL X-VIVO 15 培养液 + 10% human AB serum 及 0.2% acetylcysteine（用于培养）， 或是PBS + 1% Human AB serum（仅用于回测） • 选择合适的收集管，并调节分选液流加电，使得 分选液流尽可能打在培养基、PBS、血清的液面 上，而不是管壁 • 收集后的细胞，用250g,10分钟进行离心，小心 取上清，用于后续实验
BD FACSAriaIII流式 分选仪的原理及应用
BD生物科学 孔祥涛
400-819-9900
COE_BDB_China@
流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快 速、准确、客观，并丐能够同时检测直线流动状态中的单个 细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技 术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、 单兊隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
分析型流式细胞仪 VS 分选型流式细胞仪
Calibur
AriaIII
Catch tuber （捕获管分选）
• 唯一可选配分选装置
的小型机。
提升活性
• 减少样本收集前后的处理过程，去除不必要的离 心和重悬
• 减少剪切力效应，轻柔使用移液枪
• 为减少细胞吸附到管壁，收集管使用聚丙烯材质， 并用100% human AB serum包被
• 分选中可暂停，轻柔混匀样本管和收集管，确保 细胞悬浮
分选后
• 分选后回测需要确保前后条件一致，确认进样针 管路无残留，回测样本无酚红
电子偏转的方式
流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
完美的分选速度Fra bibliotek纯度得率
高速分选的影响因素
•鞘液压力（Pressure ) •振荡频率 (Drop Frequency) •喷嘴大小 (Nozzle) •上样速度(Sample Flow Rate )
Thanks!
BDB 孔祥涛 400-819-9900
Purity and sort coincidence
• Purity is also maintained by detecting sort coincidence
Sort coincidence Two or more particles are too close together to be separated in two individual drops
高纯度分选,来自于分析的精度
Aria III 液滴32等分分析
Yield Mask
Tips: 如何提升分选的纯度
• 设置合适的分选模式 • 选择合适的喷嘴孔径 • 确保稳定的液流断点 • 设置正确的drop delay
• 进行4路分选时，将纯度要求高的细胞分选设置在 最外的2路
• 减少样本的粘连 • 正确的设门 • 确保上样管路清洁后回测
• Ficoll分离过的PBMC使用PBS+ 1% human AB serum 调整浓度到 1–2 x 107 PBMCs/mL
分选中
• 设门去除粘连体细胞
• 正确的分析 • 对于需要后续培养或是对于内毒素特别敏感的细 胞，建议完成无菌分选准备流程 • 选择合适的分选精度 • 选择合适的喷嘴孔径 • 选择合适的上样速度以保证纯度和得率
高得率分选,来自于液流稳定性
Sweet Spot — 液滴断点自动监测
• 液滴断点监测窗口 • 振幅自动调节，维持断点稳定
• 阻塞报警，保护分选样本不受
污染，实现分选时无人看管 • 提高分选纯度和得率
高纯度分选,来自于精确地充电
Accudrop —— 液滴延时自动控制
• 丏利的BD Accudrop技术能够自动地精确确定液滴延迟时间（细胞 颗粒与激光正交的时间和细胞颗粒到达断点处的时间这两个时间的 间隔）, 保证最高的分选纯度及得率。 • 全部自动完成精确计算，无需手动调节，并可实时监测。
Tips: 如何提升回收率
• 降低分选速度
• 减少纯度要求 • 正确的drop delay
• 正确的加电
• 合适的收集管
• 保护细胞活力
• 正确的设门
Aria III 对细胞的保护 — 高活性
影响细胞活性的因素： clean 1. 无菌处理 — Auto 1. 细胞本身状态 2. 圆滑管路设计
2. 细胞受到的撞击 3. NG流动池— 低功率激光照射 3. 激光照射 4. 电子减速 4. 细胞所处温度影响 5. 分选样本温控系统 5. 系统洁净程度 （4、25、37、42）
5、检查和更换快速接头o-ring 6、使用PBS（不要使用生理盐水），PBS要过滤（0.2um）
仪器的维护保养
7、选择合适的喷嘴和压力 8、液流启动完，立刻用DI清洗Closed Nozzle ，定期超声 清洗Closed Nozzle
9、更换Pinch Valve 管道
10、定期对上样架上润滑剂 11、做CS&T质控 12、定期整理实验实验数据（Data Manage）