一.实验设计方案实验序号一实验名称马铃薯脱毒试管苗的快速繁殖和试管薯的诱导实验时间2012-4-10至2012-6-15实验室生科院3241．实验目的①熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。
②掌握无菌操作的基本技术；了解马铃薯脱毒种薯生产的过程，为脱毒种薯的生产提供必要的基础苗。
③进一步熟悉配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基；掌握马铃薯试管薯形成的条件，设计适合的马铃薯试管薯诱导培养基。
④通过本次实验，掌握马铃薯试管薯诱导的方法和技术。
2．实验原理、实验流程或装置示意图实验1-1 MS培养基母液和常用试剂的配制培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。
配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。
母液的浓度为培养基浓度的10倍、100倍或更高。
实验1-2 马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
实验1-3 马铃薯试管苗的快速繁殖利用适宜的培养基，诱导带有腋芽的马铃薯单节茎段进行芽生长和根再生形成单苗，从而达到快速繁殖的目的。
实验1-4 马铃薯试管薯诱导培养基的配制将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
实验1-5 马铃薯试管薯的诱导在培养马铃薯脱毒试管苗的培养容器中（试管苗培养4-6周），加入液体的马铃薯试管薯诱导培养基，置于全黑暗条件下即可诱导马铃薯试管苗结薯。
3．实验设备及材料设备冰箱、50ml三角瓶、500ml搪瓷杯、25ml量筒、1ml和5ml吸管、pH试纸（5.4~7.0）、封口膜、橡皮筋、扎口用棉线、药勺、称量纸、普通电子天平、移液管、量筒、烧杯、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、超净工作台等。
药品及试剂MS基本培养基母液、马铃薯快速繁殖培养基、蒸馏水、75％酒精、蔗糖、琼脂、NAA、6-BA、水解酪蛋白、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、。
实验材料: 马铃薯脱毒苗4．实验方法步骤及注意事项方法步骤:1-1 MS培养基母液和常用试剂的配制在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。
MS培养基母液包括大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。
可按照以下步骤配制为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存4.1大量元素母液的配制MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外可由KNO3、NH4NO3、CaCl2 •2H20、MgSO4 • 7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中母液种类成分规定用量/mg•L-1扩大倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1L MS培养基吸取量/ml大量KNO3 1900 38000 NH4NO3 1650 33000元素CaCl2 • 2H20 440 20 8800 1000 50MgSO4 • 7H2O 370 7400KH2PO4 170 34004.2微量元素母液的配制MS培养基中的微量元素可由MnSO4 •4H2O、ZnSO4 •7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4 • 2H2O、CuSO4 • 5H2O、CoCl2 • 6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见下表）。
母液种类成分规定用量/mg• L-1扩大倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1L 培养基吸取量/ml微量元素MnSO4 • H2O 16.920033801000 5 ZnSO4 • 7H2O 8.6 1720H3BO3 6.2 1240KI 0.83 166Na2MoO4 • 2H2O 0.25 50CuSO4 • 5H2O 0.025 5CoCl2 • 6H2O 0.025 54.3分母液的配制MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）母液种类成分规定用量/mg•L-1扩大倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1LMS吸取量/ml有机成分甘氨酸 2.020100250 5 盐酸硫胺素0.1 5盐酸吡哆素0.5 25烟酸0.5 25肌醇100 5000▪▪▪▪4.4铁盐母液的配制确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至 5.8 →定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。
用时每配l L培养基取该溶液5ml。
母液成分规定用量扩大倍数称取量/mg母液定容体积配1L MS吸取量种类/mg•L-1/ml /ml铁盐Na2EDTA • 2H2O37.32001865250 5 FeSO4 • 7H2O27.8 13904.5生长调节物质母液的配制对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml-1或 ppm 较为方便，一般配制成0.1-1mg·ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。
2,4-D/NAA用少量95％酒精溶解，再加水定容；6-BA应先溶于少量1 mol·L-1的HCl中，再加水定容。
母液种类成分称取量(mg )母液定容体积(ml )母液浓度(mg/ml)生长调节物质2,4-D/NAA 501000.5 6-苄氨基嘌呤10 0.14.6用试剂的配制盐酸（lmol·L-1 ）：用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制氢氧化钠（lmol·L-1 ）：用固体氢氧化钠配制75%酒精(v/v) ：用95%的酒精来配制稀铬酸洗涤液：重铬酸钾50 g溶于1000 ml蒸馏水中，冷却后缓慢加入工业用硫酸90 ml。
1-2 马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制▪配方： MS基本培养基＋0.7％琼脂＋3％蔗糖▪配制体积：每小组配制0.5L（１）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（0.７～0.８％），撕碎后放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。
（２）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后加蒸馏水至所需体积。
（３）调节培养基的酸碱性至pH5.8:培养基若偏酸时用lmol·L-1 NaOH来调节，偏碱则可用lmol·L-1 HCl来调节。
一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。
（４）培养基的分装:占其容积的1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。
培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。
（５）培养基的灭菌:温度121℃时保持15～30 min左右即可。
(6)接种工具准备:分别取枪状镊子2把、眼科手术剪和手术刀各1把，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；每套培养皿内放入合适滤纸2～3张，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；然后和培养基一起统一灭菌。
1-3 马铃薯试管苗的快速繁殖▪（1）准备工作:①接种室的清洁和消毒②超净工作台的开机和消毒③剪刀、镊子、已灭菌培养皿、酒精棉球、酒精灯、待用培养基等的准备④实验材料的准备▪（2）无菌操作①实验操作前，操作人员洗手及手和小臂消毒（注意问题？）②使用的镊子、解剖刀等用95％酒精浸泡，之后放在酒精灯上灼烧灭菌，再放在灭菌后的培养皿中冷却后使用。
③培养瓶外壁的消毒④将马铃薯试管苗剪为单节茎段后接种到培养基中，在植入材料的前后，培养瓶的瓶口须在酒精灯火焰上烧烤灭菌。
⑤封口、标记、将培养瓶置于培养架上，在温度20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12-14小时/天的条件下培养。
1-4 马铃薯试管薯诱导培养基的配制▪配方： MS基本培养基＋3mg/L6-BA＋8％蔗糖▪配制体积：每小组配制0.5L，用100ml三角瓶分装成10瓶。
（1）药品及用具的准备（2）培养基配制（3）调节培养基的酸碱性至pH5.8（4）培养基的分装（5）培养基的灭菌1-5 马铃薯试管薯的诱导（1）准备工作a 接种室的清洁和消毒；b 超净工作台的开机和消毒；c 剪刀、镊子、培养皿、待用培养基等的准备；d 实验材料的准备（2）马铃薯试管薯的诱导方法固体培养法、液体培养法、固液双层培养法，本次采用固体、液双层培养法。
（3）无菌操作在无菌条件下将液体的马铃薯试管薯诱导培养基加入到用固体培养基培养马铃薯试管苗的容器中，置于黑暗条件下诱导马铃薯试管苗结薯。
注意事项:①在配制MS培养基母液时，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。
力求Ca2+与SO42- 和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。
同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。
②配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。
最好在2～4℃的冰箱中保存,发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用③培养基灭菌时注意:▪1灭菌前检查锅内是否有足够的水；▪2装锅不可过满；▪3培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。
▪4当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。
切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。
5．实验结果:⑴实验现象：诱导共得到马铃薯微型薯3瓶，两瓶均无污染。
三瓶中的微型薯长势不错，但马铃薯苗出现轻微的倒伏现象。
第一瓶共有6株苗，第二瓶共有4株苗，第三共有5株苗，其中第一瓶中有6个微型薯（未拍摄），第二瓶中有微型薯4个（未拍摄），第三瓶中有微型薯4个（未拍摄）。
第一瓶中微型薯直径超过0.5厘米的有5个，第二瓶中微型薯直径超过0.5厘米的有3个。
微型薯呈现淡黄色，其中直径较大的颜色偏白，直径较小的颜色偏黄。
⑵实验现象分析：两瓶中几乎所有的试管苗都产生了微型薯，产生的微型薯数量也较多，但直径超过0.5厘米的微型薯不多，究其原因可能是培养时间不够长。