20
中新口腔
常见荧光素： A.FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm B.PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm C.PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 D.PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm E.APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
675nm
抗体的选择： ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度：APC >PE >PerCP >FITC
Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01
中新口腔
光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP 500/50
PE较强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适21用于强表达抗原
中新口腔
常见荧光物质的应用
Fluorophores Conjugated to an Ab
Dead Cell Dyes (DNA staining)
PM1 (Orange) Add nm PE
PI
Live Cell Dye (DNA Staining) Fluorescent Proteins Cell Tracking Dyes
1. 样本准备(贴壁细胞)：弃去培养细胞(对数生长期) 中的旧培 养液，加入胰酶消化细胞，。收集旧培养基，通过离心获得凋亡或 死亡细胞，与之后消化后的细胞混合，再检测。 2. 细胞染色：在 96-well 微孔板相应的孔中加入 100ulGuava Nexin（货号：4500-0450）和100ul 准备好的细胞悬液，室温避光 孵育 20min；尽快用流式细胞仪获取结果（1h 内）。 3. 流式细胞仪检测获取数据。 注意：实验最好包括实验组、阴性对照和阳性对照（凋亡诱导组） 。
10e1
10e2
10e3
CD20-FITC (GRN-HLog)
10e4
35
Count
18
0
中新口腔
点阵图：根据多因素区分细胞亚群
血细胞分群 （红细胞溶解后
）
25
中新口腔
荧光补偿
光谱重叠的校正： 目前使用的荧光染料都是 宽波谱，两两之间的发射 谱范围有一定的重叠。为 了克服这种误差，可使用 荧光补偿电路，设置合理 的荧光信号补偿。
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.
中新口腔
70
53
直方图：可根据单一因素区分细
胞亚群
M2
70 cells each have a green fluorescence intensity of about 400
M1
Notice the subpopulation?
10e0
10
中新口腔
电子器件
检测器 、光电二极管、光电培增管
功能:
1) 量化电压脉冲
2) 将模型信号转换 成数字信号
3) 荧光补偿
4) 数据传给电脑以 便分析
11
中新口腔
软件系统
12
中新口腔
InCyte 开放模块Flexibility
整合多组 数据
分析方式 灵活
R1
拖曳式设门，操
作简单易学
R2
多种Plot 以供选择
利用核酸标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内 DNA 的相对含量 进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。但是分裂期（M期）的 前期、中期、后期、末期四个时期，普通流式无法进行定量检测。
中新口腔
3
1. DNA细胞周期分析
31
中新口腔
1. DNA细实胞验周期步分析骤及注意事项：
1、细胞周期固定：
加 200ul 细胞（贴壁培养的细胞需要先用胰酶消化）到 1.5ml 离心管 中→300×g 转速离心 5min，并用 1×PBS 清洗一次→离心去上清→ 添加300ul PBS 溶解沉淀细胞→缓慢加入－20℃预冷的100%乙醇 700ul 固定细胞（固定过程中需要边滴加乙醇，边震荡，不要产生细胞 聚团，否则会严重影响实验结果）→最后乙醇终浓度为 70%→－20℃ 孵育至少 3 小时（建议 4℃孵育过夜，效果会更好）。
33
中新口腔
2.早期细胞凋亡检测结果
CD95/FASL 刺激诱导凋亡
正常细胞： Annexin V(-) / 7-AAD (-) 早期凋亡细胞：Annexin V (+) / 7-AAD (-) 晚期凋亡细胞：Annexin V (+) / 7-AAD (+)
34
中新口腔
2.早期细胞凋亡实检验测结步果骤
“大小”
成正比例关系: • 截面积大小 • 折射率 light scatter – 区分细胞与细胞碎片
SSC: Side-angle (90) light scatter – 在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。
中新口腔
Scatter – How it works
39
中新口腔
抗体表达
+
多指标检测
40
中新口腔
中新口腔
4
LP 500 = >500 nm
SP 500 = <500 nm BP 500/50 = 475 nm – 525 nm
9
中新口腔
easyCyte 5HT system
激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm)
检测荧光通道： Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm
PM2 (Red) PM3 (Green)
PE-Cy5 7-AAD
FITC
LDS751
GFP CFSE
中新口腔
直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. –X-Axis: 荧光信号强度. –Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis：两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
2、将固定好的细胞 300×g 转速离心 5min，并用 1×PBS 清洗一次。 将细胞用 200ul的 Guava 细胞周期试剂重新悬浮，室温孵育 30min， 注意避光。
3、用200目细胞筛过滤细胞（如果使用PI染色必须过滤），显微镜下 细胞无结团，Guava 流式细胞仪检测。
32
中新口腔
2.早期细胞凋亡检测
Do it！（合适的细胞密度并避免细胞结团）
27
中新口腔
应用范围
28
中新口腔
实验对照的设计
➢ 空白对照 ALL ：采用不标记的细胞进行平行测定，用于确定待测标本的 基础荧光域值或检测染色方法是否成功。
➢ 阴性对照：调节各荧光探测器合适的放大倍数，即确定待测标本的基础 荧光域值。常用同型对照（与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量 和相同亚型的免疫球蛋白），用于消除抗体与细胞非特异性结合产生的 背景。
IC50 即半数抑制浓度，是指一种药物能将细胞生长、病毒复制等抑 制 50%所需的浓度。
EC50 即半数效应浓度，是指引起受试对象 50%个体产生一种特定效 应的药物剂量。
使用 Guava Incyte 软件，可以自动进行 IC50/EC50 计算和曲线绘制。
38
中新口腔
抗体表达
多样本单指标检测
Sheath Fluid: ~10 mL/Test Waste：1L / hr run 10万—100万cells/Test
中新口腔
微毛细管流动池
20mm 50-100mm
8
Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second
0.1mm
Probe Volume = 200 pl
Volume = 200nl
➢ 阳性对照：用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验，通 常用于检测抗体是否正常或确定实验方法的稳定性和准确性。
➢ 补偿对照：多色分析时，将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本进 行单色标记，以测定荧光信号的光谱重叠情况以进行调节。
➢ 单色分析：设同型抗体对照 ➢ 多色分析：同型对照，补偿对照 29
中期——Caspase 家族蛋白分布于各条凋亡通路上，是中期凋亡的指 标。活化 Caspase 蛋白检测可以使用 FLICA 底物。
晚期——DNA 片段化是凋亡晚期的显著特征。通过 TUNEL 法对断裂 的 DNA 片段进行标记。
36
中新口腔
Guava Incyte IC50/EC50 自动 分析
6
Fluorescently Labelled Antibody
Single Cell Suspension
中新口腔
液流系统
功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。
No Sheath Fluid Waste： <10ml /hr run 2千—1万 cells/Test
中新口腔
我需要准备什么？
1.Why ： 为什么进行流式细胞检测？ 流式细胞技术是否是最佳的检测方法？ 检测的原理是什么？ 要检测的物质是什么？
2.Where：荧光标记的物质在哪里？ 是否需要对细胞进行固定？打孔？
3.Which：选择什么荧光标记物？ 4.How: 样品制备流程，多少个标本？（空白对照、阴性对照……） 5.When: 预约（175874947群共享下载申请表）
35
中新口腔