流式细胞检测课件
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常见荧光素: A.FITC(异硫氰酸荧光素):绿色 530nm B.PE(藻红蛋白):橙黄色 575nm C.PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白):深红色 D.PI(碘化丙啶):橙红色 620nm E.APC(别藻兰蛋白):红色 660nm
675nm
抗体的选择: ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度:APC >PE >PerCP >FITC
Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01
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光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP 500/50
PE较强,适用于弱表达抗原 FITC最便宜,适21用于强表达抗原
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常见荧光物质的应用
Fluorophores Conjugated to an Ab
Dead Cell Dyes (DNA staining)
PM1 (Orange) Add nm PE
PI
Live Cell Dye (DNA Staining) Fluorescent Proteins Cell Tracking Dyes
1. 样本准备(贴壁细胞):弃去培养细胞(对数生长期) 中的旧培 养液,加入胰酶消化细胞,。收集旧培养基,通过离心获得凋亡或 死亡细胞,与之后消化后的细胞混合,再检测。 2. 细胞染色:在 96-well 微孔板相应的孔中加入 100ulGuava Nexin(货号:4500-0450)和100ul 准备好的细胞悬液,室温避光 孵育 20min;尽快用流式细胞仪获取结果(1h 内)。 3. 流式细胞仪检测获取数据。 注意:实验最好包括实验组、阴性对照和阳性对照(凋亡诱导组) 。
10e1
10e2
10e3
CD20-FITC (GRN-HLog)
10e4
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Count
18
0
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点阵图:根据多因素区分细胞亚群
血细胞分群 (红细胞溶解后
)
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荧光补偿
光谱重叠的校正: 目前使用的荧光染料都是 宽波谱,两两之间的发射 谱范围有一定的重叠。为 了克服这种误差,可使用 荧光补偿电路,设置合理 的荧光信号补偿。
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的,也可以是对数的.
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70
53
直方图:可根据单一因素区分细
胞亚群
M2
70 cells each have a green fluorescence intensity of about 400
M1
Notice the subpopulation?
10e0
10
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电子器件
检测器 、光电二极管、光电培增管
功能:
1) 量化电压脉冲
2) 将模型信号转换 成数字信号
3) 荧光补偿
4) 数据传给电脑以 便分析
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软件系统
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InCyte 开放模块Flexibility
整合多组 数据
分析方式 灵活
R1
拖曳式设门,操
作简单易学
R2
多种Plot 以供选择
利用核酸标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内 DNA 的相对含量 进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。但是分裂期(M期)的 前期、中期、后期、末期四个时期,普通流式无法进行定量检测。
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3
1. DNA细胞周期分析
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1. DNA细实胞验周期步分析骤及注意事项:
1、细胞周期固定:
加 200ul 细胞(贴壁培养的细胞需要先用胰酶消化)到 1.5ml 离心管 中→300×g 转速离心 5min,并用 1×PBS 清洗一次→离心去上清→ 添加300ul PBS 溶解沉淀细胞→缓慢加入-20℃预冷的100%乙醇 700ul 固定细胞(固定过程中需要边滴加乙醇,边震荡,不要产生细胞 聚团,否则会严重影响实验结果)→最后乙醇终浓度为 70%→-20℃ 孵育至少 3 小时(建议 4℃孵育过夜,效果会更好)。
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2.早期细胞凋亡检测结果
CD95/FASL 刺激诱导凋亡
正常细胞: Annexin V(-) / 7-AAD (-) 早期凋亡细胞:Annexin V (+) / 7-AAD (-) 晚期凋亡细胞:Annexin V (+) / 7-AAD (+)
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2.早期细胞凋亡实检验测结步果骤
“大小”
成正比例关系: • 截面积大小 • 折射率 light scatter – 区分细胞与细胞碎片
SSC: Side-angle (90) light scatter – 在细胞大小相同的情况下,区分不同的细胞种类。
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Scatter – How it works
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抗体表达
+
多指标检测
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LP 500 = >500 nm
SP 500 = <500 nm BP 500/50 = 475 nm – 525 nm
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easyCyte 5HT system
激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm)
检测荧光通道: Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm
PM2 (Red) PM3 (Green)
PE-Cy5 7-AAD
FITC
LDS751
GFP CFSE
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直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. –X-Axis: 荧光信号强度. –Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis:两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
2、将固定好的细胞 300×g 转速离心 5min,并用 1×PBS 清洗一次。 将细胞用 200ul的 Guava 细胞周期试剂重新悬浮,室温孵育 30min, 注意避光。
3、用200目细胞筛过滤细胞(如果使用PI染色必须过滤),显微镜下 细胞无结团,Guava 流式细胞仪检测。
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2.早期细胞凋亡检测
Do it!(合适的细胞密度并避免细胞结团)
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应用范围
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实验对照的设计
➢ 空白对照 ALL :采用不标记的细胞进行平行测定,用于确定待测标本的 基础荧光域值或检测染色方法是否成功。
➢ 阴性对照:调节各荧光探测器合适的放大倍数,即确定待测标本的基础 荧光域值。常用同型对照(与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量 和相同亚型的免疫球蛋白),用于消除抗体与细胞非特异性结合产生的 背景。
IC50 即半数抑制浓度,是指一种药物能将细胞生长、病毒复制等抑 制 50%所需的浓度。
EC50 即半数效应浓度,是指引起受试对象 50%个体产生一种特定效 应的药物剂量。
使用 Guava Incyte 软件,可以自动进行 IC50/EC50 计算和曲线绘制。
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抗体表达
多样本单指标检测
Sheath Fluid: ~10 mL/Test Waste:1L / hr run 10万—100万cells/Test
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微毛细管流动池
20mm 50-100mm
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Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second
0.1mm
Probe Volume = 200 pl
Volume = 200nl
➢ 阳性对照:用已知表达某种抗原的细胞(阳性细胞)进行平行实验,通 常用于检测抗体是否正常或确定实验方法的稳定性和准确性。
➢ 补偿对照:多色分析时,将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本进 行单色标记,以测定荧光信号的光谱重叠情况以进行调节。
➢ 单色分析:设同型抗体对照 ➢ 多色分析:同型对照,补偿对照 29
中期——Caspase 家族蛋白分布于各条凋亡通路上,是中期凋亡的指 标。活化 Caspase 蛋白检测可以使用 FLICA 底物。
晚期——DNA 片段化是凋亡晚期的显著特征。通过 TUNEL 法对断裂 的 DNA 片段进行标记。
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Guava Incyte IC50/EC50 自动 分析
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Fluorescently Labelled Antibody
Single Cell Suspension
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液流系统
功能:传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本:0.2-150微米的粒子,最快可在1秒种内计测数万个细胞。
No Sheath Fluid Waste: <10ml /hr run 2千—1万 cells/Test
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我需要准备什么?
1.Why : 为什么进行流式细胞检测? 流式细胞技术是否是最佳的检测方法? 检测的原理是什么? 要检测的物质是什么?
2.Where:荧光标记的物质在哪里? 是否需要对细胞进行固定?打孔?
3.Which:选择什么荧光标记物? 4.How: 样品制备流程,多少个标本?(空白对照、阴性对照……) 5.When: 预约(175874947群共享下载申请表)
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