miR-17在细胞衰老中的表达变化课题研究：王怡丹指导教师：符永兰（北京师大二附中）王苗（北京师范大学生命科学学院）该文获2010年西城区科技创新大赛二等奖摘要:miRNA（全称microRNA，通用简称是miRNA，以下简称miRNA，miR-17是13号染色体长臂上的miRNA）是一种长约22个碱基的小RNA,近些年来miR-17被报道在许多肿瘤中表达上调。

但miR-17在衰老细胞中的表达还没有报道。

目的:本实验的目的是建立年轻和衰老的WI38细胞系,检测已知在多种肿瘤中高表达的miR-17细胞衰老中的表达情况。

方法:通过传代培养细胞，细胞计数确定细胞代数，β-Gal染色检测细胞是否衰老。

用Trizol试剂提取细胞的总RNA,逆转录获得cDNA 模板。

最后通过实时定量PCR比较miR-17在年轻和衰老细胞中的表达。

结果:构建了年轻和衰老的WI38细胞系，发现与在肿瘤细胞中相反，衰老细胞中miR-17的表达水平显著降低。

这一结果预示miR-17可能同时参与细胞衰老和肿瘤的发生发展。

一、综述（一）细胞衰老1.细胞衰老概述衰老是一种有机体的死亡危险随年龄增加而增大的现象，是生命的基本现象，也是生物界的普遍规律。

随着衰老研究及分子生物学的迅猛发展，人们对衰老的探究已经逐渐深入到细胞、基因及分子水平。

1961年，L.Hayflick做过这样的实验，体外培养的人体某种细胞，最多分裂50次左右就停止分裂了，并且丧失了正常的功能[1]。

这种原来具有分裂能力的细胞随着整体年龄增长而减缓或停滞分裂的现象叫做细胞衰老。

成纤维细胞WI38是研究细胞衰老的经典模型。

衰老细胞与年轻细胞相比，在形态结构和生理生化反应上会出现明显的变化，主要表现在膜透性及脆性增加，核膜内陷，核增大，核中染色质凝聚、破碎，线粒体数量减少，胞内脂褐素等异常物质沉积等。

在pH=6时，衰老细胞的酸性β-半乳糖苷酶染色呈阳性。

2.细胞衰老的机制从诱因来看衰老一般分为复制型衰老和过早型衰老两种，由于细胞分裂增殖进而端粒缩短或端粒机构的破坏而引起的人类和某些物种细胞的衰老称为复制型衰老，这是人类和某些物种细胞衰老的主要机理[2]。

由外界因素诱导比如，离子辐射，氧化胁迫，某些肿瘤抑制因子和癌基因的过表达诱导的衰老称为过早型衰老。

3.细胞衰老与肿瘤的关系细胞衰老是细胞经历的不可逆的生命过程，在这个时期里，组成细胞的化学物质在运动中不断受到内外环境的影响而发生损伤，造成退化时期生理功能下降和紊乱。

当机体组织受到某些外界或内源的刺激时，导致细胞发生转化，脱离了正常的周期而不断进行无限增殖时，肿瘤即便产生。

可见，细胞衰老作为细胞的一种主要的肿瘤抑制机制，与癌变有着密切的联系。

多种研究表明，当细胞处于发生癌变风险的情形下，会诱发细胞发生衰老。

（二）miRNA1.miRNA概述miRNA是一种长度约为22个碱基的小RNA,在动物、植物和真菌中广泛存在，可以在转录后水平调节基因的表达。

迄今发现的miRNA在生物的发育，细胞增殖，凋亡，衰老和肿瘤发展中发挥调节功能。

2. miRNA与肿瘤miRNA调控转录后水平的基因表达抑制或者是基因沉默的方式，很多与信号通路中细胞周期调控的转录因子及相关蛋白有关，且近来研究发现50%有注释的人类miRNAs集中于基因组的脆性位点， miRNA 突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs 可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。

这就注定了其与癌症等疾病有着重要的关联。

3. miRNA与衰老正如miRNA对生长发育的调节作用一样,科学家们也猜测是否miRNA在衰老和死亡过程中也起到重要作用。

在秀丽隐杆线虫模型中发现，miRNA lin-4，通过胰岛素/类胰岛素生长因子-1信号通路影响寿命和衰老的节奏。

缺失lin-4会缩短线虫的寿命[3]。

利用基因芯片的技术，在不同的模式生物中，人们发现随着年龄的变化，miRNA的表达图谱发生改变。

随着miRNA在细胞发育，增殖，凋亡及癌症中的调节作用逐步被揭示。

miRNA 调节衰老的机制及miRNA如何参与细胞衰老的信号通路等问题将成为今后miRNA研究的热点之一。

4．miR-17miR-17位于13号染色体长臂. miR-17所在的mir-17基因簇被认为是一个致癌基因，表达该基因可促进细胞增殖，抑制肿瘤细胞的凋亡，导致肿瘤发生等。

在B 淋巴细胞瘤中，miR-17所在的基因簇会高表达，同时抑制肿瘤细胞的凋亡。

原癌基因c-Myc可以诱导miR-17的表达，而miR-17可以抑制转录调控因子E2F1的表达。

从而促进c-Myc介导的细胞增殖，与肿瘤形成相关。

在其它一些造血细胞瘤及实体瘤中，该基因簇的高表达也被证明可以促进肿瘤发生[4]。

由上述实验结论可知，mir-17通过调节转录调控因子E2F1等靶基因起到了调节细胞周期，影响细胞增殖、分化的作用。

这与细胞衰老的分子机制息息相关。

此外，近期的报道也证实其在心、肺及免疫系统等正常细胞组织发育中起到了重要作用。

（三）立题依据miR-17位于人13号染色体长臂，已有报道显示miR-17在许多恶性肿瘤中存在高表达，包括肺癌，胰腺癌，结肠癌等。

衰老作为细胞的一种主要的肿瘤抑制机制，与癌变有着密切的联系。

虽然人们对细胞衰老相关蛋白的作用有比较深入的了解，但细胞衰老的调节机制还不是很清楚，近些年来科研人员发现miRNA可能与细胞衰老的调节有关。

miR-17是miRNA家族中的一员，据报道miR-17在许多肿瘤中高表达，参与肿瘤的发生和发展。

但miR-17是否调节衰老还没有报道。

鉴于miR-17在多数肿瘤中存在异常表达，并与肿瘤的发生发展有关，我们推测miR-17可能参与细胞衰老过程的调节,细胞衰老和癌变存在某些共同的调控机制。

为了研究miR-17在细胞衰老中的调节作用，本课题主要研究miR-17在细胞衰老过程中的表达情况。

二、实验部分（一）实验材料WI38，人胚肺成纤维细胞。

mir-17 逆转录引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACactaccmir-17实时定量PCR引物：上游引物:GCAAAGTGCTTACAGTGCAGGT下游引物:GTGCAGGGTCCGAGGT（二）试剂DMEM，Trypsin-EDTA, L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin 购自GIBCO公司；DEPC 购自Sigma公司；M-MLV Reverse Transcriptase 购自Promega公司；DNase I 购自Ambion公司；琼脂糖(Agarose), 酵母提取物(Yeast Extract), 胰蛋白胨(Trptone)购自OXOID 公司SYBR Green超混合物购自Biorad公司DMF，K3Fe(CN)6，K4Fe(CN)6，Citric Acid，Na2HPO4，KH2PO4，KCl，MgCl2，NaCl，溴化乙锭（EB）,甲醛溶液，戊二醛，琼脂粉(Agar) 购自科海军舟（三）实验方法1.细胞复苏实验目的:将冻存的细胞复苏，使细胞贴壁生长1.1 培养基在37℃水浴锅温浴1.2 从液氮中取出细胞，立即放入37℃水浴锅1.3 冻存管中冻存液融化后，立即将其放入15ml离心管中，加入5ml预热好的培养基，1200转离心5分钟1.4 吸出上清，用10ml预热好的培养基重悬细胞，放入10mm培养皿中，将细胞混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中，使细胞贴壁并培养1.5 3天后，吸去旧的培养基，加入10ml新鲜培养基2.细胞传代和细胞计数实验目的:使细胞的密度适合细胞的生长和分裂，并计算细胞生长的代数2.1吸去培养基，用PBS洗细胞一次，加入1ml胰酶2.2 放入37℃，5%CO2培养箱，孵育3分钟，将贴壁的细胞消化下来2.3 用5ml培养基将细胞吹吸均匀，吸取100μl,放入10ml细胞计数液中2.4 将5×105细胞放入10mm培养皿中，加培养基到10ml,将细胞混匀，放入37℃培养箱中，使细胞贴壁并培养2.5 3天后，吸去旧的培养基，加入10ml新鲜培养基细胞代数的计算方法如下：△PD=lg（A/B）/0.3PDA=△PD+PDBA为当前细胞数量，B为接种时细胞数量，△PD为细胞从接种至此时的代数增加值，PDA为当前细胞的代数，PDB为接种时细胞的代数。

3.细胞冻存实验目的:长期保存细胞，为以后的实验保存实验材料3.1吸去培养基，用PBS洗细胞一次，加入1ml胰酶3.2 放入37℃，5%CO2培养箱，孵育3分钟，将贴壁的细胞消化下来3.3用5ml培养基将细胞吹吸均匀,将细胞吸至15 mL离心管中，1200转离心5分钟3.4 吸除上清，加入适量冻存液（完全培养基加5%DMSO）将细胞吹打均匀，分装入冻存管中，放入程序降温盒于-80℃过夜3.5移入液氮罐中长期保存。

4 .β-gal 染色实验目的:检验细胞是否衰老WI38细胞进入50代后，细胞生长速度放缓，细胞逐渐衰老，此时对细胞进行β-gal 染色处理，可观察过表达细胞系与对照组细胞衰老的程度是否存在差异，进一步鉴定过表达目标基因对复制性细胞衰老的影响。

4.1准备细胞将细胞分至新的35mm培养皿中，每盘0.1M，每种细胞3盘平行，生长24小时后，进行β-gal 染色。

4.2β-gal 染色从细胞培养箱中取出细胞，用PBS清洗2-3次，取适量固定液，室温固定5分钟。

倒掉固定液，用PBS清洗2-3次，加入适量染色液，37℃放置12-16小时。

倒掉染色液，PBS清洗1次，显微镜下观察。

5. 细胞总RNA的提取实验目的:提取年轻和衰老细胞的RNA,为检测miR-17的表达提供实验材料5.1从细胞培养箱中取出细胞，用预冷的PBS洗2-3次，加入1mlTrizol试剂，用刮刀刮取细胞，室温放置5-8分钟。

5.2向其中加入0.2ml氯仿，剧烈混匀15秒钟，室温放置3分钟，4℃、12000 转离心15分钟。

5.3取无色水相，加入0.5mL异丙醇，室温放置10分钟，4℃、12000 转离心10-15分钟。

5.4弃上清，加入1mL75%乙醇，混匀，4℃、10000 转离心5分钟。

5.5弃上清，空气中干燥10-20分钟，加入20µl0.1%DEPC水,57℃水浴10分钟，取出置于-80℃保存。

6.总RNA浓度测定实验目的:对年轻和衰老细胞的RNA进行定量利用分光光度计对所提取的RNA浓度进行测定，原理及步骤与DNA浓度的测定相似，RNA在OD260处有最大吸收峰，纯的RNA其OD260/OD280为2，该值大于1.6说明样品纯度可以使用。

7.DNA酶Ⅰ处理总RNA实验目的:去除RNA中的DNA,防止DNA污染在无RNA酶的离心管里建立如下反应体系：10×DNA酶I缓冲液: 3μlRNA 10μgDNA酶I 1μl加无RNA酶的水到终体积 30μl37℃作用10分钟，70℃15分钟灭活DNA酶 I。