第一章 绪论

生物反应工程：将生物技术的实验室成果经工艺及工程开发而成为可供工业生产的工艺过程。其实质是利用生物催化剂从事生物技术 产品的生产过程。

生物反应工程（Bioreactor Engineering）是一门以生物学、化学、 工程学、计算机与信息技术等多学科为基础的交叉学科，它以生物反应 动力学为基础，将传递过程原理、设备工程学、过程动态学及最优化原理等化学工程学方法与生物反应过程的反应特性方面的知识相结合，进行生物反应工程分析与开发，以及生物反应器的设计、操作和控制等。

一、生物反应过程应由四部分组成：

1.原材料的预处理 原材料的选择，必要的物理与化学方法加工，培养基配制和灭菌

2.生物催化剂的制备 菌种的选择、扩大培养和接种，酶催化反应中的纯化、固定化等

3.生物反应器及反应条件的选择与监控 反应器的结构、操作方式和操作条件，反应参数的检测与控制

4.产品的分离纯化 用适当的方法和手段将含量甚少的目的产物从反应液中提取出来并加以精制以达到规定的质量要求

二、生物反应过程的特点：

1.是一门综合性学科

2.采用生物催化剂

3.采用可再生资源为主要原料

4.与一般化工产品生产相比，其生产设备比较简单，能耗较低

三、生物反应过程的分类：

① 酶的反应过程：采用游离或固定化酶为催化剂反应。

② 细胞反应过程：采用活细胞为催化剂时的反应过程，包括一般微生物细胞发酵反应过程、固定化细胞反应过程和动植物细胞 培养过程。

③ 废水的生物处理过程：利用微生物本身的分解能力和净化 能力，除去废水中污浊物质的过程。

四、生物工程与生物反应工程

① 生物反应工程的上游加工：最重要的生物催化剂（包括菌株、酶、及其固定化）的制备。掌握生物催化剂的生理生化特性和培养特性，解决大规模种子培养或固定化催化剂制备以及如何在无菌情况接种。

② 生物反应器：存在着物料的混合与流动、传质与传热等大量的化学工程问题；存在着氧和基质的供需和传递、发酵动力学、酶催化反应动力学、发酵液的流变学以及生物反应器的设计与放大等一系列带有共性的工程技术问题；同时还包括生物反应过程的参数检测和控制。

③ 生物反应工程的下游加工：对目的产物的提取与精制。这是因为一方面生物反应液中目的产物的浓度是很低的；另一方面反应液杂质常与目的产物有相似的结构，加上一些具有生物活性的产品对温度、酸碱度十分敏感，一些作为药物或食品的产品对纯度、有害物质都有极严格要求。总之，下游加工步骤多，要求严，其生产费用高。

第二章 固定化酶和固定化菌体

第一节 微生物酶

一、微生物酶：微生物生活细胞产生的具有催化作用和专一激活能力的蛋白质。

二、微生物酶的优越性：

1、酶的来源：动物、植物、微生物。

2、（1）微生物生长速度快，易于大量培养。

（2）通过菌种选育改进培养条件，便于人为提高产量。

（3）菌种不同，产生酶的种类有差异。 （4）利用微生物酶反应，以活菌体进行催化，简化工艺，缩短反应周期。

（5）产量高、成本低、不受季节限制，便于工业化生产。

3、菌体内酶与菌体外酶

菌体内酶：产生的酶分布在微生物细胞内，又叫胞内酶。

胞内酶的使用：

（1）把酶从菌体细胞内抽提出来。繁杂、易失活

（2）固定化细胞。用一定的方法将微生物菌体固定在载体上制成固定化菌体。简单、利用率高、不易失活。

如：大肠杆菌产生的青霉素酰胺酶的利用。

菌体外酶：产生的酶分泌到菌体外，又叫胞外酶。

胞外酶的使用：

（1）除去菌体，把含酶的培养滤液直接用于生物催化反应。

（2）把酶抽提出来用一定的方法制成“固定化酶”。

如：葡萄糖淀粉酶与羧甲基纤维素（CMC）离子结合制成的固定化酶

第二节 酶的特性

一、酶的专一性

绝对专一性：一定的酶只能作用于一定的底物。酶对底物有很强的选择性。能从多种复杂的底物混合物中与特定底物反应。如：脲酶只能作用于尿素。

相对专一性：一种酶除能与特定底物作用外，也能与同底物化学结构相类似的底物起作用。酶对底物的选择性较低。如：D－氨基酸氧化酶能催化多种D－氨基酸脱氨。

立体异构专一性：一种酶只能作用于旋光异构体的一种或顺反异构体的一种。如：L－乳酸脱氢酶只能作用于L－乳酸。反丁烯二酸酶只能作用于分丁烯二酸。

二、影响酶反应速度的因素：受温度、氢离子浓度、酶浓度、底物浓度等因素影响。

三、直接利用微生物酶——（缺点）

（1）不稳定。在高温、高压、强酸、强碱下。

（2）易失活。即使在最适合的条件下反应。

（3）回收困难。用适当方法提取目的产物后，残存酶回收困难。

（4）反应速度减慢。随着反应时间的推移。

（5）经济上不合算。一次性反应后不能再次使用。

第三节 固定化酶

固定化酶：水溶性酶通过物理和化学的方法，使之与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。

一、酶固定化后的性质变化

1 对底物的特异性。尤其注意立体结构对催化底物特异性的影响。

2 酶反应最适PH值的改变。酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规律，可调整固定化方法，获得最适合的反应条件。

3 动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变

4 酶反应温度的改变

5 增加酶的稳定性。对热、PH值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。连续化反应稳定性好。——固定化酶的最大好处

二、固定化酶的形态和作用模型

1 制备固定化酶的方法：化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种。

2 制备时应注意： （1）保护酶蛋白的立体结构不变。

（2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用

（3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等 3 （1）化学方法制备的固定化酶的形态结构模型

1 离子结合法

2 交联法 3

载体结合法 4 架桥法 5 网络结合 6 酶网

（2）物理方法制备的固定化酶的形态结构模型

1 物理吸附法 2 包埋法 3 微型胶囊法 4 凝胶格子型

5 空心纤维型 6 纤维丝型

（3）物理化学结合法制备的固定化酶的形态结构模型

1 架桥、包埋结合法；2 包埋与离子结合法；3 共价结合包埋法 （4） 载体的作用： ▼保持酶的立体结构 ▼保护酶的活性中心 ▼保证酶的连续催化反应

4、酶的固定化方法举例

（一） 载体结合法制备固定化酶

1 常用载体

粒子大小、网目结构表面积大小、亲水性部分的量、化学组成等方面考虑。

纤维素、右旋糖酐、葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃

2 常用方法

按载体结合形式分为：

共价键结合法 ：酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。

（1）酶与载体反应的主要功能基团

游离羟基：肽链C－末端的α –羧基，天门冬酰氨酸，谷氨酸的β－γ羧基

游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基，赖氨酸ε －氨基

巯基：半胱氨酸

羟基：丝氨酸，苏氨酸

酚基：酪氨酸

咪唑基：组氨酸

（2）所用载体

重氮化法：具有氨基的不溶性载体（R－NH2）。以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。

多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃

烷 化

法：卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素）

含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）

（3）固定化酶的制备机理：将与载体反应的功能基团与各种重氮化剂、烷化剂等反应形成共价键制

备固定化酶。

（4）优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长时间使用。

缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏

离子键结合法：

酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶

（1）所用载体 纤维素的衍生物，离子交换树脂

（2）固定化酶的制备机理 酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子交换剂上。

（3）优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶

缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落

物理吸附法

（1）常用载体

无机物：活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶

有机物高分子化合物：淀粉麸质、大孔树脂、DEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶

（2）固定化酶的制备机理：所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。 （3）优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的高级结构;方法简单，成本低。

缺点：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应

（二） 包埋法制备固定化酶

酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。

1、 格子型固定化酶

（1）原理

以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。反应为厌氧反应。

（2）方法

2、微型胶囊法

（1）原理：把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。

（2）特点：a 微囊直径几微米～几百微米。

b 低分子底物可以自由通过并进入微囊内。

c 与酶反应后的生成物被排除在微囊外，

d 酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，

e 外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内

（3）方法——表面聚合法、液中干燥法、相分离法

(5)优点： A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。

B 能很好地保存天然酶的活性和特性。

C 大小可任意调节，制备时间短。

缺点： 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防治酶的失活和变性。

（三） 交联法制备固定化酶

概念：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶