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（2）突变细胞的筛选方法 （3）突变性状的稳定性鉴定
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13.1.8 植物快繁技术
（1）离体快繁技术体系的建立 （2）植物快繁技术的应用
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13.2 基因工程与育种
植物基因工程是指按照人们的意愿进行严密的设计， 经体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造植物种性， 使现有物种在较短时间内趋于完善，创造出新种质的过 程。它是近30年来随着DNA重组技术、遗传转化技术及 离体培养技术的发展而兴起的生物技术。自1983年第一 株转基因烟草获得以来，植物基因工程的研究进展迅速。 迄今为止，国内外已得到60种以上转基因植物，其中玉 米、棉花、马铃薯、烟草和大豆等已大面积种植。
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1）分子标记的分类
第一类为基于DNA-DNA杂交的DNA标记，主要包 括限制性片段长度多态性（RFLP）标记和可变数量串 联重复序列（VNTR）标记。 第二类是基于PCR（聚合酶链式反应）的DNA标记。 第三类为基于PCR技术与限制性内切酶技术相结合 的DNA标记，为两种技术的有机结合，如扩增片段长度 多态性（AFLP）标记和酶切扩增多态性序列（CAPS） 标记等。 第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记，即SNP 标记。
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13.1.4 胚培养
杂种胚由于营养或生理的不协调而导致难以播种成 苗，或在发育早期就败育或退化，把杂种胚在败育或退 化之前直接剥离出来接种于培养基上进行早期离体培养 的方式叫做杂种胚挽救。离体胚培养可以克服种间乃至 属间受精障碍、打破种子休眠、缩短育种周期、克服种 子生活力低下和自然不育等，通过成熟胚和未成熟胚离 体培养已获得了不少的园艺植物。
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（2）原生质体融合的方法 常用的方法有聚乙二醇法（PEG法）、电融合法、高pH-高 浓度钙离子法和NaNO3等。 （3）杂种细胞的选择 杂种细胞选择的方法概括起来有两种，一种是利用物理方法 进行选择，另一种是利用杂种细胞的生长特性或突变体互补进行 选择。 （4）体细胞杂种植株的再生及鉴定 形态学鉴定 细胞学鉴定 生化鉴定 DNA检测鉴定
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2）未授粉子房培养 （1）材料的选择 接种时胚囊所处的发育阶段对子房培养的成败起着 关键性作用。有的可根据开花前的天数、未开放花蕾长 度来选择子房进行培养，但更多的是根据胚囊发育时期 的相关性来选择较准确的培养时期，接近成熟的胚囊较 容易诱导成功。 （2）培养基及培养条件 常用的基本培养基有MS、N6和BN等，蔗糖质量浓 度多为3%～10%之间，激素种类及配比因不同材料而 异。
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13.1.7 体细胞无性系变异
植物细胞、组织、器官在无菌条件下进行离体人工 培养，经过脱分化和再分化的过程，重新形成愈伤组织 和完整植株称为体细胞无性系。在培养阶段发生变异， 进而导致再生植株也发生遗传改变的现象，称为体细胞 无性系变异。无性系变异在园艺植物离体培养中普遍存 在，由于很多园艺植物都是无性繁殖的，发现无性系变 异后，很快就能通过无性繁殖固定下来，所以无性系变 异的研究在园艺植物上更为活跃，在育种上的应用成果 相对也较多。 （1）突变体的产生
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1）成熟胚培养
（1）成熟胚培养的意义 （2）材料的消毒与接种 （3）培养基及培养条件
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2）原胚培养
（1）原胚培养的概念及意义 （2）材料的选择 （3）培养基及培养条件
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13.1.5 胚乳培养
（1）胚乳发育期的选择 （2）胚乳愈伤组织的建立 （3）培养基与培养条件
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（3）接种培养 消毒后的花蕾在无菌条件下，用镊子剥去花瓣，取 花药接种于MS、N6、Nitsch等基本培养基上，并将花 丝、空瘪及受伤花药剔除。培养温度因不同植物而异， 一般在25～28℃之间。
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2）花粉培养
（1）花药预处理和预培养 预处理方法有黑暗处理、光质处理、高渗处理、药 物处理及温度处理等。多采用的是，取花粉处于合适发 育期的花蕾，臵于4～10℃下处理1～15天。花药预培养 也是行之有效的方法，具体是灭菌后的花药臵于甘露醇 溶液中，漂浮预培养2～5天，取出花药后再分离花粉培 养；也可在无菌条件下取出花药，接种于Nitsch等培养 基中预培养数天，然后将花粉分离出来，再进行悬浮培 养，小孢子可启动发育。
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3）转基因植物生物安全性问题的对策
①继续完善转基因技术 ②加强对基因工程生物及其产品的安全性和可能产 生的危害进行研究 ③建立完善的检测体系和质量审批制度 ④有关决策层应对转基因产品的产业化和市场化速 度进行有序调控 ⑤通过多渠道、多层次的科普宣传，培养公众对转 基因产品及其安全性问题的客观公正意识，从而培养对 转基因产品具有一定了解、认识和判断能力的消费群体， 并规范转基因产品市场。
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13.2.1 基因工程的基本原理与技术
转基因技术大致可划分为两类：一类是载体介导法， 即利用另一种生物来实现基因的转入和整合，如农杆菌 介导法和病毒介导法等；另一类是DNA直接摄取法，即 将裸露的DNA 通过物理或化学的方法直接转入植物细 胞，如基因枪法、聚乙二醇（PEG）介导法、花粉管通 道法、电击法、显微注射法、超声波导入法等。目前较 常用的几种植物转基因技术有农杆菌介导法、基因枪法、 聚乙二醇（PEG）介导法及花粉管通道法。
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第13章 生物技术在园艺植物育种中的应用
13.1 细胞工程与育种
植物细胞工程是指以植物细胞全能性为理论基础，以植物组 织及细胞培养为技术支持，在细胞水平上对植物进行遗传操作， 实现植物改良和利用，或获得植物来源的生物产品的生物技术。 植物细胞工程主要包括植物组织与器官培养技术、花药及花粉培 养技术、胚胎培养技术、离体受精技术、体细胞突变体筛选技术、 原生质体培养与细胞融合技术等。近年来，随着这些技术的发展 与完善，及其与常规育种技术的有效集成，在快速繁殖、种质保 存、品种选育和遗传改良等许多领域得到广泛运用，显示出了巨 大的潜力。
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13.1.6 原生质体培养与融合
1）原生质体分离 （1）植物材料的灭菌与处理 （2）酶液处理 （3）原生质体的收集与纯化 2）原生质体培养 （1）液体培养 （2）培养方法 固体培养和液体培养均可，应注意原生质体的湿度及培养的 温度和光照。 3）原生质体融合 （1）原生质体融合的概念及意义
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13.3 分子标记辅助育种
13.3.1 分子标记的概述 所谓分子标记有广义和狭义之分，广义的分子标记 是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质；而狭义分 子标记则是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差 异的特异性DNA片段。分子标记的特点如下：①直接以 DNA的形式表现，在植物的各个组织、各个发育时期均 能检测到，不受环境影响，不存在表达与否的问题；② 数量极多，遍及整个基因组；③多态性高，自然存在许 多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料；④不影 响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁；⑤许多分 子标记能够鉴别纯合基因型和杂合基因型，提供完整的 遗传信息。
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（2）材料预处理与灭菌 在大多数情况下，只有经过预处理的花药才能培养 出完整的单倍体植株。预处理的方法有低温、高温、离 心和预培养等，目的是要从形态上改变其极性分布，从 生理生化上改变其细胞生理状态，以改变其分裂方式和 发育途径。 经预处理后的花蕾，用乙醇进行表面灭菌后再用次 氯酸钠或升汞灭菌后即可接种。
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13.1.3 离体受精
所谓离体受精也称离体授粉，就是把未授粉的胚珠或子房从母体上切离下来， 进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌的花粉，使之在试管内实现受精。应用这项 技术，可使花粉不经柱头和花柱组织而直接进入子房中的胚珠，有可能克服孢子体不 亲和，从而得到远缘杂种。此外，这项技术也为外源特异基因的有性转移、诱导遗传 转化开辟了广阔的应用前景。 1）离体子房受精 离体子房受精就是将不同发育阶段的子房连同一段花梗，经消毒后，接种在培 养基上，再授以无菌的花粉。花粉可以用不同浓度的硼酸、蔗糖配成花粉悬浮液，在 子房上切一个开口，把花粉悬浮液滴入切口中，也可用注射器直接把花粉悬浮液注入 子房内，最后将子房接种于培养基上进行培养。此技术是一种接近于自然情况的授粉 技术。 2）胚珠试管受精 为了提高胚珠培养的成活率，通常选用带有胎座的胚珠进行培养。胚珠包裹 在子房内，处于无菌状态，只需子房消毒后直接在无菌条件下把胚珠剥离出来接种于 培养基上进行培养。授粉时可以直接把无菌的花粉撒在胚珠上，也可先将花粉撒在培 养基上，然后把带有胎座的胚珠接种在散播花粉的培养基上进行授粉。
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（2）重组体DNA分子的构建 （3）基因扩增 （4）重组体DNA分子导入受体细胞 （5）检测和培养 （6）转基因植物的大规模种植
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13.2.2 基因工程在园艺植物遗传育种中的应用