细胞凋亡的生物学意义
1 2 3 4 胚胎发育和形态发生 细胞稳态和免疫机制 衰老 肿瘤发生及化学治疗
细胞凋亡和恶性肿瘤
1 Bcl-2和恶性肿瘤 - 和恶性肿瘤 2 P53和恶性肿瘤 和恶性肿瘤 3Bcr-abl和恶性肿瘤 和恶性肿瘤 4 PML-RARα蛋白和恶性肿瘤 蛋白和恶性肿瘤
细胞凋亡干预和肿瘤治疗
3 透射电镜观察
未处理的HL 60细胞 HL图8A 未处理的HL-60细胞 透射电镜× 透射电镜×6000
DADS处理的HL-60细胞 处理的HL 图8B DADS处理的HL-60细胞 透射电镜× 透射电镜×6000
4 DNA断片法或称琼脂糖凝胶电泳"梯形条带"图谱法 断片法或称琼脂糖凝胶电泳" 断片法或称琼脂糖凝胶电泳 梯形条带"
荧光显微镜观察
未处理的HL 60细胞 HL图9A 未处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40
DADS处理的HL-60细胞 处理的HL 图9B DADS处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40
3 电子显微镜观察法
电镜下超微结构观察虽可显示凋亡细胞的许多特 点,如膜发泡和某些结构如微纤毛的丢失,染色质固 缩和线粒体超浓缩等,但由于样本制备复杂,耗时, 该项技术主要用于获取细胞凋亡的定性检测.
细胞凋亡死亡受体相关信号途径
细胞凋亡死亡受体相关信号途径
表3 序号 Caspase-1 Caspase-2 Caspase-3 Caspase-4 Caspase-5 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-8 Caspase-9 Caspase-10 Caspase-11 Caspase-12 Caspase-13 Caspase-14 caspase 家族主要成员 功能 辅助炎症 凋亡反应 凋亡反应 辅助促炎症 辅助促炎症 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 凋亡反应 底物特异性 WEHD DEXD DEXD WEHD WEHD (I/L/V)EXD DEXD (I/L/V)EXD (I/L/V)EXD 原名 ICE ICH-1 CPP32,Yama,apopain ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2 Ⅱ ICErel-Ⅲ,TY Ⅲ Mch-3 Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1 FLICE,MACH,Mch-5 ICE-LAP6.Mch6 Mch4 ICH-3 ERICH MICE(Mini-ICE)
细胞凋亡线粒体相关信号途径 MMP开放 开放
Porin 线粒体外膜 Cyclophilin D
PBR
ANT △φm 下降
Cyto C/Apaf-1/procaspase-9
AIF caspase-9-caspase-8
caspase-3
apoptosis
Bax
MitoTracker
overlay
HL-60
Time(h)
0
1
2
4
8
24
Pro-caspase3
Pro-caspase9
Cyt-c
GAPDH
作用HL-60细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图30 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
K562 Time(h) 0 1 2 4 8 24
Pro-caspase3 Pro-caspase9 Cyt-c GAPDH
1 野生型 野生型P53基因介导的肿瘤治疗 基因介导的肿瘤治疗 2 Bcl-2基因介导的肿瘤治疗 - 基因介导的肿瘤治疗 3 泛素-蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗 泛素- 4 三氧化二砷介导的血液系统恶性肿瘤治疗 5 DADS诱导肿瘤细胞凋亡 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡的检测方法
1 台肦蓝(trypan blue)染色法 台肦蓝( 染色法
原理: 是一种细胞膜非通透性染料. 原理:trypan blue 是一种细胞膜非通透性染料.坏死 细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色.因此, 细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色.因此,该法能 区分细胞的生存状态,简单,便捷,常规用于细胞死亡 区分细胞的生存状态,简单,便捷, 的初步评价和细胞存活率评价. 的初步评价和细胞存活率评价. 注意事项: 注意事项:该法不能区别继发性坏死和真正意义上的 坏死细胞;也容易低估细胞死亡程度.(因为早期凋亡 坏死细胞;也容易低估细胞死亡程度.(因为早期凋亡 .( 细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞) 细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞)
3.3 流式细胞仪检测凋亡率
35 30 apoptotic cells(%) 25 20 15 10 5 0
untreated PD SB DADS5 DADS10 DADS10+PD DADS10+SB
Fig15 Effects of SB205980 and PD98059 on DADS -induced apoptosis in HL-60 cells
作用K562细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图31 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
Raji Time(h) 0 1 2 4 8 24
Pro-caspase3 Pro-caspase9 Cyt-c GAPDH
作用Raji细胞后 细胞后caspase3的表达变化 图32 DADS作用 作用 细胞后 的表达变化
图5 不同浓度DADS作用HL-60 不同浓度DADS作用 作用HL 细胞24h后DNA梯状条带的形成 细胞24h后DNA梯状条带的形成
图6 60 molL-1 DADS作用HL-60 DADS作用 作用HL 细胞不同时间后DNA梯状条带的 细胞不同时间后DNA梯状条带的 形成
转移酶dUTP缺口末端标记法) 缺口末端标记法) 5.TUNEL法(末端 法 末端DNA转移酶 转移酶 缺口末端标记法
内源性细胞凋亡抑制物
1 Caspase-8(FLICE)抑制蛋白(FLIP) 抑制蛋白( - ( 抑制蛋白 2 SODD(silencer of death domain) 3 IAP(inhibitor of apoptosis protein) ( 4 Survivin 5 Bcl-2家族蛋白 家族蛋白
2.丫啶橙染色(acridine orange, 2.丫啶橙染色( 丫啶橙染色 bromide, EB)双染法 EB)双染法
AO)和溴化乙啶(ethidium AO)和溴化乙啶 和溴化乙啶(ethidium
原理:AO和EB都是结合 都是结合DNA的荧光染料 的荧光染料, 原理:AO和EB都是结合DNA的荧光染料,分别产生蓝色 和橙色荧光.其中,AO能透过完整的细胞膜,而EB则只 能透过完整的细胞膜, EB则只 和橙色荧光.其中,AO能透过完整的细胞膜 能染色胞膜受损的细胞.因此, AO/EB双染法能借助荧光 能染色胞膜受损的细胞.因此, AO/EB双染法能借助荧光 显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死或 继发性坏死细胞. 继发性坏死细胞. 注意事项:应用单一形态学计数凋亡细胞数( 注意事项:应用单一形态学计数凋亡细胞数(凋亡指 数,apoptosis index)常受到主观因素的干扰,其个体间甚 index)常受到主观因素的干扰 常受到主观因素的干扰, 至同一主体的重复性较差. 测结果 TUNEL检测结果
HL图10A 未处理的HL-60细胞 10A 未处理的HL 60细胞 TUNEL ×20
处理的HL 图10B DADS处理的HL-60细胞 10B DADS处理的HL-60细胞 TUNEL ×20
6 PI染色流式细胞术测定凋亡率 染色流式细胞术测定凋亡率
原理:实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分 原理: 外漏, 含量减少.因此, 子量DNA 外漏,导致细胞内DNA含量减少.因此,应用DNA 特异荧光染料(如碘化丙啶, 染色后, 特异荧光染料(如碘化丙啶,propidium iodide, PI)染色后, 进行的细胞周期分析中, 在FCM进行的细胞周期分析中,凋亡细胞常以亚二聚体形式出 细胞. 现.亚二倍体细胞群被称为亚G1期(sub-G1)细胞.它的出现 被认为是凋亡细胞的重要标志. 被认为是凋亡细胞的重要标志. 注意事项: 期细胞的同时, 注意事项:识别亚G1期细胞的同时,必须将它和细胞碎 片区分开来, 期细胞. 片区分开来,因为细胞碎片的DNA含量也明显低于G1期细胞.
MMP开放和caspase活化的"正反馈"环
膜间蛋白(如 AIF)释放 线粒体膜 屏障 功能破坏
MMP开放
刺激ceremide酶活化 剪切MMP复合物 Caspase-3活化
线粒体肿胀
Caspase-9活化 凋亡诱导剂
Cyoto C释放
Apoptosome (procaspase-9/Apaf-1/Cyto C) 结 合 Apaf-1 procaspase-9 和
图12 PI/Anexin-V双染色流式细胞仪检测DADS作用 PI/Anexin- 双染色流式细胞仪检测DADS作用 K562细胞 K562细胞12h后凋亡率的改变 细胞12h后凋亡率的改变
图13 流式细胞仪检测DADS作用K562细胞24h,48h后的凋亡率改变 流式细胞仪检测DADS作用 作用K562细胞 细胞24h,48h
原理:凋亡细胞的基因组DNA常首先被剪切为200300kb和30-50kb的片断("结构域式"剪切),再进一步 降解产生大小相当于核小体(160-200bp)的倍数的寡核小体 片断("裂解"/"梯子式"剪切).因此,在琼脂糖凝胶 电泳图谱上凋亡细胞表现为特征性"梯子"样外观. 注意事项:梯状DNA(DNA ladder)现象常被看作是细 胞凋亡的重要生物化学标志.但是,日益增多的资料显示 并不是所有表现凋亡形态学特征的细胞都是呈现这种梯子 样外观.因此,缺乏梯状DNA并不能排除细胞凋亡的存在. 据报道,某些细胞系如K562细胞凋亡常发生单链而不是双 链DNA降解,故不能形成"DNA ladder".另外,一般凋 亡率要在15%以上才能呈现典型"DNA ladder" .故有 DNA ladder可以肯定凋亡存在,没有DNA ladder不能排 除凋亡的存在.