目录摘要 (III)关键词 (III)Abstract (III)Key words (IV)英文缩略词表 (IV)1前言 (1)1.1口蹄疫的基本特征 (1)1.1.1口蹄疫病毒基本概念 (1)1.1.2口蹄疫病毒生物学特征 (1)1.1.3口蹄疫病毒危害 (1)1.2泛素蛋白及其对抗原的影响 (2)1.3 siRNA干扰机制 (3)1.4 γ干扰素与口蹄疫免疫 (4)1.5 FMD疫苗研究进展 (5)1.6本实验研究的目的与意义 (6)2实验材料 (6)2.1菌种、毒株、载体与质粒 (6)2.2主要药品与试剂 (6)2.3主要培养基及配制 (7)2.4缓冲液及其配制 (7)2.5其他溶液 (7)2.5空斑筛选与纯化相关试剂 (8)2.6寡核苷酸引物 (8)3实验方法 (8)3.1转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建策略 (8)3.1.1限制性内切酶酶切反应 (9)3.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 (9)3.1.3酶切产物的回收 (9)3.1.4回收产物的去磷酸化反应 (9)3.1.5目的基因与载体的酶连反应 (10)3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化 (10)3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） (10)3.2.2质粒的转化 (10)3.2.3质粒的小量制备（OMEGA试剂盒） (10)3.2.4质粒的大量制备（OMEGA试剂盒） (11)3.2.5阳性质粒的酶切鉴定 (12)3.3以PRV为载体表达FMDV抗原蛋白基因P1，泛素蛋白与抗原P1的融合基因Ubi- P1，RNA干扰基因shRNA，干扰素基因IFN-γ的重组病毒的构建 (12)3.3.1细胞的培养、冻存与复苏 (12)3.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组DNA的提取 (12)3.3.3脂质体介导的共转染 (13)3.3.4重组病毒空斑纯化和PCR鉴定 (13)3.3.5鉴定用PCR模板处理 (14)3.3.6重组病毒PCR鉴定 (14)4结果与分析 (15)4.1转移质粒PIECMVUbiP1的构建 (15)4.2转移质粒PIECMVUbiP1P1的构建 (15)4.3转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建 (16)4.4共转染产物接毒第三代PCR鉴定 (17)4.5重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定 (18)4.5.1空斑的形成 (18)4.5.2在PK-15细胞上的第一轮空斑筛选 (19)4.5.3在Vero细胞上的第一轮空斑筛选 (20)4.5.4 重组病毒的空斑筛选结果 (20)5讨论 (20)5.1 载体的构建 (20)5.2 细胞的传代培养 (21)5.3 空斑筛选实验 (21)5.3.1 空斑筛选细胞的选择 (21)5.3.2 RNA干扰对空斑筛选结果的影响 (22)5.3.3干扰素γ对空斑筛选结果的影响 (22)参考文献： (22)致谢 (24)猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建The construction of recombinat Virus for Generating a Novel Genetic Engineering Vaccine Agansit O Type FMDV ofPig摘要口蹄疫是一种急性、高度传染性的病毒性传染病，虽自20世纪初口蹄疫疫苗已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及动物产品贸易的障碍。
由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株PRV TK-/gE-/LacZ+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用人工合成的O型口蹄疫P1基因作为抗原基因，用和泛素（Ub）融合的UbiP1作为另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫3B基因设计的shRNA和具有抗病毒及免疫调节效果的猪IFN-γ与以上两个功能基因串联，构建了具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和PRV缺失株TK-/gE-/LacZ+共转染细胞，发生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有P1基因、UbiP1、shRNA、IFN-γ四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因工程疫苗打下基础。
关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒AbstractFoot and mouth disease (FMD) is an acute, highly contagious virul infection disease. Although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. The vector virus PRV TK-/gE-/LacZ+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. This study we selecte synthetic O type FMDV P1 gene as antigen gene, P1 and ubiquitin (Ub) fusion gene UbiP1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. Then use shRNA designed for 3B gene of FMD, IFN-γ gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, constructed transfer vector with four functional gene. Making the transfer vector and the PRVTK-/gE-/LacZ+ cotransfected in cells. After the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genesof P1 gene, UbiP1, shRNA and IFN-γ, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine.Key words：antigen gene; ubiquitin; interferon gene; recombinant virus英文缩略词表AbbreviationFMDV Ub UPS RNAi siRNA shRNA SIF IFNγPRV NCS Amp DMEM LB PBS PCR SDS EB OD EDTA PK Vero DMSO MEM Foot-and-Mouth disease virusUbiquitinUbiquitin-proteasome systemRNA interferenceRNA interference geneRNA interference geneInterference gene fragmentγ-interferon genePseudorabies virusNewborn calf serumAmplicillumDulbecco's Modified Eagle MediumLuria-Bertani mediumPhosphate buffer solutionPolymerase chain reactionSodium dodecylsulphateEthidium bromideOptical densityEDTA Disodium SaltPig kidney cellsAfrican green monkey kidney cellsDimethyl sulfoxideMinimal Essential Medium口蹄疫口蹄疫病毒泛素泛素蛋白酶系统小RNA干扰小RNA干扰基因小RNA干扰基因干扰基因区段γ干扰素基因伪狂犬病病毒新生牛血清氨苄青霉素改良Eagle培养基LB培养基磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠溴化乙锭光密度乙二胺四乙酸猪肾细胞非洲绿猴肾细胞二甲基亚砜微小型培养基1前言1.1口蹄疫的基本特征1.1.1口蹄疫病毒基本概念口蹄疫(Foot-and-month disease, FMD)是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus, FMDV）感染引起的人畜共患的急性、烈性传染病，该病全世界分布广泛，主要感染偶蹄类，一旦爆发常造成巨大的经济损失。
由于存在制作灭活苗灭活不彻底和毒力返强造成的潜在危险，开发新型基因工程疫苗已引起人们的重视。
1.1.2口蹄疫病毒生物学特征口蹄疫病毒呈球形，正二十面体结构，直径20-25nm;无囊膜，对酸碱敏感，口蹄疫病毒粒子由衣壳和病毒核酸构成，衣壳由60个不对称的亚单位组成，每个亚单位含一分子的VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP4位于病毒颗粒内部。
FMDV属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，有7个血清型，即O，A，C，SAT 1, SAT 2, SAT 3和AsiaⅠ型(Rodriguez and Grubman, 2009)，各个血清型间无交叉反应（陆承平等，2005），病毒的这种特性，给其检疫、防疫带来极大的困难。
FMDV基因组为具有感染性的单股正链RNA，大小约8.5kb，只有一个开放的读码框(open reading frame, ORF)，两侧各有一个非编码区(non coding region, NCR)。
开放读码框首先翻译为一个多聚蛋白，经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白以及一些中间体。
FMDV基因组P1区编码结构蛋白，P12A前体物在3C蛋白酶作用下形成由VP4-VP2，VP3和VP1组成的原体。