室温放置的酸奶中乳酸菌分析食品科学与工程：呼庆真指导老师：吴士云摘要：本文通过对室温放置的酸奶的品质进行鉴定，分析酸奶贮藏过程中各乳酸菌种的消长演替情况，通过对酸奶的耐受性分析、测定总酸、乳酸菌总数、菌种的菌种菌落形态、细胞形态的连续培养观察，得出在常温下贮藏和销售时酸奶乳酸菌含量在第五天为 1.2×106cfu/mL（福淋酸奶30℃时），第十天为1.5×106cfu/mL（光明酸奶30℃时）。
酸度均大于70°T，在国标的范围之内。
同时，结合生化试验分析菌种的耐酸耐高温特性，应用该菌种进行产品发酸试验，表明此菌应用范围宽，经驯化后可用于其它非乳制品的发酵，为研发活菌制剂提供基础资料。
关键词：酸奶，乳酸菌,保加利亚杆菌,嗜热链球菌，耐酸性.前言近些年来，随着人们对微生物益生作用认识的不断提高，越来越多的乳酸菌被广泛应用于医疗、食品和饲料领域。
不同种类的乳酸菌适应生长在不同的环境条件下，它们在自然界分布广泛。
人类及动物的肠道内、奶制品中及一些植物的表面都存在着不同类型的乳酸菌。
随着人们生活水平的提高及自我保健意识的增强，乳制品日益受到广大消费者的喜爱。
酸奶中含有大量的活性乳酸菌。
乳酸菌可定居在人体的鼻黏膜或消化道等处，所产生的代谢产物能降低肠道内的pH值，抑制肠道中腐败菌生长，减弱腐败菌在肠道的产毒作用，从而维持体内微环境，尤其是肠道内正常的微生态平衡[1]。
用于酸奶的乳酸菌菌种主要是嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌；益生菌酸奶的乳酸菌菌种有嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等。
乳酸菌活菌体需达到一定数量，才有可能到达并定植在人体肠道内，抑制有害菌的增殖和活动，维持肠道的微生态平衡，增进人体的健康。
对这类产品质量检测时进行活菌计数，即用乳酸菌数量来评价活性[2]。
因此，酸奶中活性乳酸菌的含量是评价产品对于人体营养与保健作用的重要指标，而酸奶的pH值及酸度直接影响成品的质量、风味和口感。
新的酸奶国家标准(GB2746-1999)中规定产品中的乳酸菌数量不得低于1×106cfu/mL，酸度应≥70°T[3]。
酸奶营养丰富，与普通牛乳比较，其蛋白质和钙更易被人体消化吸收。
酸奶中含有大量活力较强的乳酸菌，它们定居在人体的嘴、鼻黏膜或消化道、肠道等处。
在这些小环境里，乳酸菌产生的乳酸可以抑制一些腐败菌和病原菌的繁殖，从而维持体内这些小环境尤其是肠道内正常的微生态平衡[4]。
酸奶还有增强消化、促进肠道蠕动和机体物质代谢，产生抗菌素、防衰老、抗肿瘤的作用。
在新世纪的今天，酸奶作为世界公认的长寿食品之一，正愈来愈受到人们的重视和喜爱。
酸度是消费者对普通凝固型酸奶接受程度的一项重要指标，因为对于这种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共生发酵的产品来说，酸度与风味和质量变化息息相关[4]。
高酸度的产品在我国特别是东北地区很难被接受，所以研究酸奶在贮存过程中的酸度和pH值的变化是十分必要的。
而酸奶中的乳酸菌数是反映酸奶营养价值的最主要指标。
酸奶一般均要求贮藏条件为2~4℃的低温环境，而我国某些地区由于条件限制无法完全实现冷链运输和销售。
本文将酸奶制品进行较长期放置，通过分析酸奶中乳酸菌的消长，随着酸度的增加，乳酸菌数量有所变化，存活的活菌的耐酸性能有所增强，结合生化试验分析菌种的耐强酸条件，为研发活菌制剂提供基础资料。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 供试样品福淋酸奶（市售，当日），光明酸奶（市售，当日）1.1.2培养基1.1.1.1 MRS培养基[5]蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，琼脂14.0g，吐温80 1.0g，pH值6.5±0.2，温度25℃。
1.1.1.2 改良M17琼脂培养基（用于乳酸菌球菌的分离培养）[6]胰蛋白胨5.0g，鱼肉浸出汁5.0g，牛肉膏8.0g，酵母浸膏2.5g，维生素C0.5g，硫酸镁0.28g，甘油10.0g，乳糖3.0g，醋酸钠2.0g，磷酸二氢钾5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，pH值6.4，121℃灭菌30min。
1.1.1.3 改良MRS培养基(用于乳酸菌杆菌分离培养)[7]蛋白胨4g，牛肉膏2g，鱼肉浸出汁5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖20g，吐温80 0.1g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二胺2g，硫酸锰0.28g，硫酸镁0.28g，硫酸亚铁0.03g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，pH值6.4，121℃灭菌30min。
1.1.3 主要试剂胰蛋白胨、鱼肉浸出汁、牛肉膏、酵母浸膏、维生素C、硫酸镁、甘油、乳糖、醋酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、琼脂、蛋白胨、葡萄糖，吐温80、柠檬酸二胺、硫酸锰、硫酸亚铁、乙酸钠、氢氧化钠、冰醋酸、乙醇、酚酞指示剂、蒸馏水、甲基红试剂、革兰氏染色液。
1.1.4 仪器3T75-2型隔水式培养箱（余姚县恒温箱厂）；01J2003-04型立式压力蒸汽灭菌器筒（上海东亚压力容器制造有限公司）；HH数显恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂）；PHS—3D精密PH计（上海精密科学仪器有限公司）；手持式折光仪（0~32%成都泰华光学公司）；DHG-9101-3SA型电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）；AL204分析天平（梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司）；C21—SK2101电磁炉(广东美的生活电器制造有限公司)。
1.2方法1.2.1样品处理将采集样品分别存放于35℃、10℃的条件下，连续放置，其中福琳酸奶于采样当天开始。
福淋酸奶每天取样一次，光明酸奶保质期每隔两天取样，对样品进行乳酸菌计数、测定PH值及滴定总酸，直至酸奶保质期结束。
1.2.2 试验流程酸奶→定期稀释培养→对培养后的乳酸菌进行计数并观察细胞形态、测量酸奶酸度值级PH值→进行乳酸菌生物耐受性分析→试验后期观察酸奶品质并对其品质进行鉴定。
1.2.3 乳酸菌细胞形态及菌落形态观察定期取培养后的乳酸菌采用革兰氏染色观察乳酸菌的细胞形态，平板培养观察菌落形态。
并拍摄相关图片。
1.2.4 乳酸菌生物耐受性分析1.2.4.1 耐酸试验将MRS液体培养基用酸度计调节pH为2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，分别取各pH的培养基5mL置于试管中，灭菌备用。
将分离的菌株接种于MRS液体培养基中培养24h后，取新鲜菌液按1%(v/v)分别接种于上述各pH的试管中，置于37℃培养24h，观察细菌生长情况。
同时分别在培养8h后，从不同pH的培养物中取出适量的培养物接种于新鲜MRS液体营养培养基，观察细菌生长情况;对怀疑无生长的试管，用MRS平板划线培养予以确认。
1.2.4.2 高温耐受性将选出的乳酸菌接种MRS培养液，分别置于水浴中30℃、60℃培养24h，取样测定细菌存活率。
1.2.5 乳酸菌计数[8]定期取样液，然后梯度稀释样液，将稀释液分别进行平板涂布接种于改良M17培养基、改良MRS培养基，置于厌氧罐中培养48h，观察菌落形态特征，进行菌落计数，计算后即得乳酸菌数。
菌落数计数公式为：N=∑C/(n1+0.1n2)d计算式中：N 样品中菌落数；∑C 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和n1 第一个适宜稀释度平板数n2 第二个适宜稀释度平板数d 稀释因子(第一稀释度)。
1.2.6 滴定总酸及pH的测定用PHS—3D精密PH计直接测定待测酸奶的pH值，以及当时的温度，记录数据。
用标定后的0.1mol/L的NaOH溶液滴定，测定出酸奶的酸度值。
1.2.7 制品中乳酸菌发酵用途的研究[9]酸奶乳酸菌做发酵剂发酵泡菜制品（风味酸豆角）泡菜制作工艺流程：菌种活化→接种↓豆角洗净→沥干→切段→装瓶、密封→发酵→成品↑↓盐水→灭菌分析2 结果与分析2.1 制品PH和酸度的分析购置新上市新鲜的福淋酸奶和光明酸奶，分别于35℃、10℃的条件下，连续放置培养，测定两种酸奶制品的PH及酸度变化，结果见表1和表2（以下以A代表福淋酸奶，B代表光明酸奶）。
表1-a 酸奶放置过程中PH值的变化A样品Table 1-a Yogurt placed process PH change A sample温度时间0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d10℃ 4.20 4.15 4.09 4.05 4.00 3.96 3.92 3.8630℃ 4.20 4.05 3.9 3.82 3.75 3.73 3.70 3.68表1-b 酸奶放置过程中PH值的变化B样品Table 1-b Yogurt placed process PH change B sample温度时间0d 2d 4d 6d 8d 10d 12d 14d 16d 18d10℃ 4.4 4.33 4.26 4.18 4.12 4.07 4.03 3.98 3.96 3.330℃ 4.4 4.28 4.09 3.85 3.74 3.66 3.62 3.60 3.59 3.58由表1-a和1-b知，福淋酸奶和光明酸奶的pH在贮藏初期基本相当，分别为4.2、4.4。
随着贮藏时间延长，两种酸奶制品pH持续下降，其中福淋酸奶在30℃条件下的酸奶下降幅度较大，在第4天后基本保持不变，在10℃酸奶在保质期内PH持续降低，但PH较30℃时高。
而光明酸奶在30℃时在第10天后PH保持微弱减小，在10℃时前10天内降低幅度大，后期持续降低但幅度较前期小。
这说明在较适宜的温度下，酸奶中乳酸菌持续产酸，使酸奶PH降低，但随着酸度增加，乳酸菌活动受到抑制，因此酸奶PH降低幅度减小。
表2a A样品室温下酸奶贮存过程中酸度测定结果Table2a ASample room temperature process of storage acidity determination result温度放置时间（d）1 2 3 4 5 6 730℃71 75 83 91 101 109 11510℃71 73 79 84 89 92 97表2b B样品室温下酸奶贮存过程中酸度测定结果Table2b BSample room temperature process of storage acidity determination result温度放置时间（d）0 2 4 6 8 10 12 14 1630℃70 72 79 86 95 104 112 117 12310℃70 71 72 77 83 89 95 102 107由表2知，两种酸奶的酸度值随着贮存天数的增加而不断升高，酸奶在贮存期的酸度越来越高，是酸奶后酸化现象导致的。