酸奶中乳酸菌的分离与纯化
一、实验目的
1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术；
2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。

二、实验设备及材料
培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。

实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。

三、实验原理
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。

大多数不运动，少数以周毛运动。

菌体常排列成链。

根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。

在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。

乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。

四、实验步骤
1.乳酸菌培养基的制作
配方
蛋白胨 2.0g
酵母膏 2.0g
番茄汁40g
葡萄糖 2.0g
吐温0.10mL
碳酸钙 3.4g
溴甲酚绿0.02g
琼脂2～4g
水200mL
①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。

②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。

依次加
入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。

③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。

④加棉塞、包扎
⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭
菌20min。

⑥无菌检查
2.倒平板
将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。

3.制备稀释液
量取酸奶10mL，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。

用一只1 mL无菌吸管从中吸取1 mL酸奶悬浊液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。

然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10−3、10−4、10−5各种稀释度的酸奶稀释液。

4.涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10−3、10−4、10−5三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10−3、10−4、10−5三管酸奶稀释液中吸取0.2mL对号放入写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂布棒轻轻地涂布均匀。

5.培养
将接种后的平板后倒置于37℃培养3～5 d。

6.纯化
待菌落长出后，选中目标菌落。

用接种钩或无菌牙签挑取菌落边缘，并移植于新的乳酸菌培养基。

注意每一个平皿只能用于纯化1个菌。

将重新接种后的平皿置于37℃环境下培养3～5d。

然后，用显微
镜检查菌落是否单纯，若有其他菌混杂，就要再进行一次分离、纯化，直到获得纯培养。

7.保藏
将分离到的目标菌接种于乳酸菌培养基斜面上，37℃培养至斜面长满。

然后保存至4℃冰箱备用。