（3）基因的构建 基因组的构建提取某生物用适当
全部DNA
限制酶切割
许多 DNA片段
与载体录酶 核酸酶H DNA聚合酶
与体的构建
2.构建零件及其作用
（3）终止子 一段特殊结构 的DNA片段，位于基因的尾端， 作用是使转录在所需要的地 方停止。
（4）标记基因 鉴别受体细胞 中是否含有目的基因，从而将含 有目的基因的细胞筛选出来。
(5) 复制原点
（三）将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程称为转化。
2. 过程
高温变性(DNA解旋) （90~95℃）
低温退火(引物结合) （55~60℃）
多次 重复
中温延伸(互补链合成) （70~75℃）
3.特点：指数形式扩增
双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个 过程不需要解旋酶。
3.通过DNA合成仪直接合成目的基因 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以
含目的基转基因 发 雌性动物输卵 动 物 育 管或子宫
含目的基因 的受精卵
分分 化裂
移 早期 植 胚胎
3.导入微生物细胞 (Ca2+ 处理法) (1)过程
GA A T T C CTTAAG
（二）DNA连接酶——“分子缝合针”
G CTTAA
AATTC G
（二）DNA连接酶——“分子缝合针”
1.连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来， 使之成为一个完整的DNA分子
磷酸二酯键
GA A T T C C T T A AG
磷酸二酯键
2.连接酶的部位： 磷酸二酯键，不是氢键
杂交双链 单链DNA
双链DNA
2.利用PCR技术扩增目的基因 (1) 原理 PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将 基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈 指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所 以又叫做体外DNA扩增技术。
• DNA分子上具有多个限制 酶切割位点；
• 能在宿主细胞中进行自我 复制；
• DNA分子上具有特殊的标 记基因；
• 对宿主细胞无影响。
二、基因工程的基本操作程序
第一步 第二步 第三步 第四步
获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 目的基因检测与鉴定
（一）目的基因的获取1.从基因中获取目的基因3.连接酶的类型（按来源分类）
(1) E.coli DNA连接酶： 只能连接双链DNA片段互补
(来源于大肠杆菌) 的粘性末端
(2) T4 DNA连接酶： 既可以连接双链DNA片段 互补的粘 （来源于T4噬菌体） 性末端，又可以“缝合”双链DNA
片段的平末端
（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用： 将外源基因送入受体细胞
2.条件： • 能在宿主细胞内复制并稳定地保存； • 具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入； • 具有标记基因，便于筛选； • 必需是安全的，对宿主细胞无害。
3.种类： 质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
质粒
• 细菌拟核DNA之外能自主 复制的小型双链环状DNA 分子；
（二）基因表达载体的构建
质粒
重组DNA 限制酶
目的基因
DNA连接酶
（二）基因表达载体的构建
1.构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下
一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.构建零件及其作用
（1）目的基因 （2）启动子 RNA聚合酶识别 和结合的一段特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，RNA 聚合酶与之结合才能驱动基因 转录出mRNA，进而获得需要的 蛋白质。
（在G与A之间切割） C T T ︰ A A G ︰↑
中轴线
︰
↓
SmaⅠ
CCC GGG
︰
（在G与C之间切割） G G G︰↑C C C
︰
G CTTAA
AATTC G
粘性末端
CCC
GGG
GGG
CCC
平末端
切割DNA分子产生的两种不同的末端（箭头表示酶的切割位点）
（二）DNA连接酶——“分子缝合针”
GA A T T C CTTAAG
将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的 群体中储存，各个受体菌包含了某种生物所有的菌包含了一种生物部分基的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、 土壤农杆菌和动植物细胞等。
导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细 胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/3
1.导入植物细胞 （1）农杆菌转化法
（2）其他方法 基因枪法 花粉管通道法
2.导入动物细胞 (显微注射技术)
测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。
蛋白质的氨 推
mRAN
推 基因DNA的核 合
基酸顺序 测 核苷酸序列 测 苷酸序列 成
目的 基因
DNA合成仪
（二）基因表达载体的构建
用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将 目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与 切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用 下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。
1.分布：主要从原核生物中分离纯化出来
2.特点：特异性，即能够识别双 链DNA分子的某种特定核苷 酸序列，并且切割每一条链 中特定部位的两个核苷酸之 间的磷酸二酯键，使之断开。
3. 结果：在识别序列中轴线两侧切割，产生粘性末端；
在识别序列中轴线处切割，产生平末端。
↓ ︰︰
EcoRⅠ
G A A︰T T C
专题一 基因工程
基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计， 并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以 新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的 生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子 水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技 术。
一、DNA重组技术的基本工具
（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”