原代培养肝细胞就是肝细胞移植、生物人工肝得最佳生物材料。
长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量得研究 , 但要获得高活率、功能好得肝细胞,至今仍非易事。
早期主要用非酶法分离肝细胞,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法、机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法就是用可结合 Ca2＋、M g２＋得螯合剂(如枸橼酸盐或ＥDＴＡ) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。
后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。
后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶就是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。
胶原酶消化法对肝细胞损伤较小, 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。
胶原酶在消化肝得同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在得蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生得细胞内、外环境及细胞间得各种改变。
这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要得促进作用,有利于肝细胞得培养。
这种适应性改变恰恰就是机械分离法所没有得。
因此 ,要获取理想得肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。
Seglｅｎ二步灌注法为经典得胶原酶消化法,但所需设备较复杂,胶原酶消耗量大。
本研究在其基础上略加改进、作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶得用量、作用时间及作用条件就是分离成功与否得关键。
胶原酶得浓度过高 ,作用时间难以控制; 浓度过低 ,
则作用时间过长、细胞活率降低、事先用无Ｃa2 +、M g2+得灌注液进行预灌注, 去除 Cａ2+依赖性粘附因子,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+得胶原酶消化 ,胶原酶得作用需要 Ca2＋得活化 , 在 5 mmoｌ/ＬCa２+浓度下 ,用浓度为 5０0 mg/ L 得胶原酶 37 ℃条件下消化１5 mｉn 最佳。
在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在０～ 4 ℃。
肝细胞分离时, ｐH 值宜维持在 7 。
4 左右, 不低于７。
2 ,最高不超过７。
6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤、在肝灌注液中加入适量得小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢与液体渗透压, 提高肝细胞成活率、此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。
培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原得新培养板与没有铺过胶原得新培养板 ,铺过胶原得老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原得新培养板中长势更好、新得培养板使用 Sigm a公司提供得胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。
过去选择含 8％胎牛血清得Ｗ E作培养基 ,效果不错 , 但WＥ价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清得RPM 1６４0培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。
肝细胞得接种密度对其以后得生长状况有很大得影响 : 密度太小 ,细胞不易生长; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够得空间供细胞伸展、当细胞密度为 5×1０５ / m ｌ左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。
鼠尾胶为
自行配制。
Ｗiｌliams E 培养液、胎牛血清购自美国 Gｉｂco 公司。
BT０1—1０0 蠕动泵( 保定格兰蠕动泵有限公司)、Ｓoｒｖall 低温离心机( 美国 Kｅnｄｒo 公司), ＣＬ—800 全自动生化分化仪( 日本岛津), XD-101 倒置显微镜( 南京
光学显微镜公司)。
HeraeuｓCO 2孵箱( 美国Ｋendro公司), ＫＴ—90２洁净室( 无锡康达净化空调设备厂)、
实验步骤:
一、原代大鼠肝细胞得分离
１.实验动物 Sprａgure- Dawｌeｙ ( ＳD ) 大鼠购自泸州医学院实验动物中心。
雄性,清洁级,体重１5０~２0０ｇ,8～12 周龄。
分笼饲养,喂饲标准得大鼠饲料,随意饮水,保持室温20 ℃～25 ℃。
2.主要仪器设备: 倒置相差显微镜();自动平衡微型离心机:ＬDZ4- 0.8 北京医用离心机厂;套管针();超净工作台();电子分析天平();外科手术器械()
３、主要试剂及药品: Ⅳ型胶原酶();RＰMＩ16４０培养基();胎牛血清();台盼蓝();Pｅｒcoｌl分离液();PBS缓冲液();青霉素(8０万U)及链霉素(10０万U)()胰岛素、高血糖素、转
铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松
4、具体实验步骤: SD 大鼠,氯胺酮80 mg/ｋg 腹腔内麻醉.同时腹腔内注射 1 0０0 U 肝素钠注射液抗凝.固定大鼠仰卧位于超净工作台上 (用前紫外灯照射超净台半小时),剪去胸腹部体毛,碘伏胸
腹部皮肤消毒后,带无菌手套,铺洞巾,取腹部正中切口,可见鲜红得肝脏,暴露出门静脉与肝下下腔静脉,用弯头钳子钝性分离门静脉与下腔静脉,并在各静脉下放置１根 4 零细线,暂不结扎,用套管针以约１5°角在门静脉远端向近端平行刺入 (注意针头刺入在距离门静脉 3 个分支处 0。
5 cm,刺入过深势必影响灌注效果)、细线结扎后以封闭门静脉远端,再退出金属针心,并将套管针连接一次输液器一端,另一端接上输液瓶 (预热灌流液得输液瓶用保温套保持温度以避免温度下降过快以影响酶得消化活性).输液瓶高度距离灌流大鼠肝脏1２0 cｍ、打开输液器输钮将预热至３7 ℃无钙灌流液200mL 经一次性输液管道及连接其末端得套管针流入门静脉,控制流速约20 mL/min;另一套管针头立即插入肝下下腔静脉,细线结扎固定以防针头由下腔静脉内脱出并退出金属针心,让血液与灌流液从下腔静脉流出,用无菌平皿接流出液,保持流出端无菌,同时打开胸腔结扎肝上下腔静脉,数分钟后肝脏逐渐肿胀变淡黄色。
直到下腔静脉流出液颜色接近无钙灌流液。
约5~１0 min,改输预热至 37 ℃得０、0５%Ⅳ型胶原酶灌流液1０0 ｍL继续灌流,更换流出端得平皿,以回收胶原酶以循环使用,控制约１0 mＬ/ｍｉn.灌流持续约 5～1０min, 0.05%Ⅳ型胶原酶灌流过程中,取一根无菌湿棉签轻轻压迫肝脏表面,以判断肝脏消化得程度,待压迫肝脏后不再回缩。
表面出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙时判断肝脏已被消化充分,可以终止灌流。
离断肝脏血管、韧带及系膜,将肝脏完整取下 (注意不要碰破胃肠组织,避免造成污染),置于无菌平皿。
用眼科镊钝性撕裂肝组
织,4 ℃ RPＭI １64０完全培养基终止IＶ型胶原酶得消化作用,装入无菌1０0 mL 三ﻫ角烧瓶置摇床上,100 ｒ／miｎ,摇 10 mｉn,所得得肝细胞悬液经三层无菌纱布过滤,以除去一些大得细胞团块及被膜组织,再装入５0 ｍL 离心管,500 r/mｉn,离心 3 min,弃上清,以4℃RPMI1６40完全培养基重悬,反复离心３次,以除去血细胞、肝非实质细胞以及一些细胞碎片与少量得结缔组织、离心之后得到得肝细胞沉淀以含 4 ℃ﻫRPMI1640 完全培养基对细胞沉淀进行重悬,用吸管轻轻反复吹打肝细胞悬液使肝细胞重悬均匀后即制备成肝细胞悬液。
二、原代大鼠肝细胞得纯化取无菌得５０ mL离心管置管架上,用弯头吸管沿管壁小心地将肝细胞悬液与75％Peｒcoll 分离液按1:１铺层,底层为 75％Ｐeｒｃoll 分离液.肝细胞悬液铺加于上层,尽量减少震荡, 4 ℃, ８00 r/min, 10 ｍin离心后,离心管液体分四层,顶层为死细胞,第二层为混合肝细胞,第三层为肝实质细胞,底层为分离液.取第三层肝实质细胞用于重悬制成肝细胞悬液外,另吸取第二层混合肝细胞,加 PＢS 液稀释,再次小心依次按 1:1:1 分铺底层 5０% Pｅrcolｌ、中层２5% Peｒｃoll、顶层混合肝细胞悬液,尽量减少震荡, 4 ℃, 800 r/min, 10min 离心,底层沉淀为肝实质细胞,吸除上层液,用完全培养基重悬底层沉淀得肝细胞制成肝细胞悬液.取肝细胞悬液与台盼蓝溶液混匀后 1 miｎ内滴入血细胞计数板上计数。
三、肝细胞原代培养详细步骤
ＲＰMI1６4０完全培养基( １00 mL·L - 1胎牛血清RPMI1６4０培养基培养基、青霉素１05 U·L － 1、链霉素１00 ｍg·L － 1与胰岛素160 U·Ｌ— 1 ) 调整肝细胞悬液细胞密度,按每孔1 ×１06 个细胞接种于铺有肝细胞悬液得６孔培养板中,在37 ℃、50 mＬ·L －１ CＯ2常规培养条件下培养。
4 ｈ后换液,用ＲPMＩ１６40完全培养基继续培养,以后每2４ｈ换液1 次,在倒置显微镜下动态观察细胞得形态6 孔培养板中,在37 ℃、５0 ｍL·L — 1 CO２常规培养条件下培养。
4 h 后换液,用RPMI１64０完全培养基继续培养,以后每24 h 换液1 次,在倒置显微镜下动态观察细胞得形态变化、。