兽医生物制品学实验教学讲义实习一、弗氏佐剂的制备目的及要求掌握弗氏佐剂的制备方法及检验方法。

内容与方法弗氏佐剂是目前最常用的油乳佐剂，根据佐剂中加入或不加入死结核杆菌可分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。

在灭活疫菌苗的制备过程中常用油乳佐剂，即“弗氏不完全佐剂”。

下面我们主要介绍弗氏不完全佐剂的制备方法。

一、材料和设备：1、材料：7#白油、硬脂酸铝、司班——80、吐温——80、蒸馏水等。

2、设备：乳化泵、分析天平、离心机（4000r/min）、恒温培养箱、粘度计、高压灭菌锅、量杯、量筒、烧杯、试管、吸管（出液口径2mm）等。

二、方法：使用不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性。

疫苗生产中主要有两种基本方法。

1、剂在水中法此法将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W 乳剂。

若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。

该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。

2、剂在油中法此法将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。

该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5um左右，比较稳定。

3、油乳剂配方免疫实验动物用的佐剂配方：7#白油85ml，司班——80 15ml混合后经除菌过滤而成为弗氏不完全佐剂（FIA）；如向其中加入0.5mg/ml死结核杆菌即为弗氏完全佐剂（FCA）。

使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。

疫苗生产用乳剂配方：7#白油90ml，司班——80 10ml，混合后加2ml的吐温——80和1.5g的硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，使用前将配好的油佐剂与抗原水相1∶1混合，强力振摇，或通过胶体磨搅拌即可制成性状良好的乳剂疫苗。

大量生产乳剂疫苗时，可将94%白油与6%司班——80混合后加入2%的硬脂酸铝，经灭菌后为油相；抗原液加入2%的吐温——80为水相。

乳化时，按容量计算，油相与水相1∶1配制，先缓速混合，再通过乳化泵或胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。

但这种配方制的乳剂苗一般较粘稠，而且必须充分掌握混入抗原时的速度，在慢速搅拌油相的同时，缓慢倾入水相混合，然后再高速通过胶体磨或乳化泵充分乳化，否则易于分层。

如欲降低乳剂的粘稠度，可以增加油相的比例，例如以水与油之比达1∶2或1∶3，最高可达1∶4时，亦可获得良好的W/O乳剂疫苗。

或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2%吐温——80生理盐水，通过搅拌或乳化泵乳化，可制成双向乳剂疫苗（水—油—水乳剂）也可直接制备双向乳剂苗（或称多型乳剂Multiple emulsion abjuvant）。

双向乳剂苗的优点是：粘稠度低、在注射部位易分散、局部反应轻微及佐剂效应良好等。

三、油乳剂的检验：油乳剂检验项目包括乳剂类型检查、黏度测定、稳定性测定、粒度大小及分布的检测等，生产实际中以黏度测定和稳定性测定为主。

1、乳剂类型的测定：测定方法有多种。

①Robertson的染料法。

用“SudanⅡ油溶性染料”和“亮蓝FCF”水溶性染料，分别加入两份乳剂中，轻轻摇动，若是整个乳剂染油溶性染料即外相为油（W/O），若整个乳剂染水溶性染料即外相为水（O/W）。

②冲淡或滴于冷水表面。

此法是根据乳状液是为其外相所冲淡，将两滴乳状液放在一玻片上，于一滴中加入水，另一滴加入油，轻轻搅拌，按照易与乳状液搀合的物质（油或水）来确定外相的性质。

③电导法。

因为多数的油皆是不良导体，而水则是良导体，用万用表（10K1/2W）把两级分开插入乳剂中，能导电者外相为水，为水包油乳剂；不能导电者外相为油，为油包水乳剂。

2、黏度测定：不同黏度的佐剂有不同的测定装置，低黏度佐剂可用毛细管粘度计测定。

黏度大的乳剂测定方法有堕球法和转筒法等。

适于测乳剂苗用的是流出法，用Saybolt粘度计。

此型粘度计基本结构是一个有套层的管子，上面有溢流的坑道，底下有流出的小孔，小孔长1.225cm，孔径0.1765cm，管中容纳60ml液体，在地心重力场中流入一个特别的小瓶所需时间，以秒计数表示之。

为了简便，可用1ml吸管，出口内径1.2mm，在室温下吸满1ml乳剂，垂直放出0.4ml 所需时间作为黏度单位，适宜于注射用乳剂的黏度以2——6s左右为宜，如超过10——15s，注射时就比较困难。

3、乳剂稳定性的测定：①加速老化法。

高温37℃贮存10——30天不破乳，②离心加速分层法。

可通过离心乳剂的方式测定。

将乳剂放入试管中，以3000r/min离心15min，不分层的乳剂苗，保存1年以上无破乳现象。

4、粒度大小及分布的测定：用显微镜直接观察，或用光散射法和透射法或以测微尺测定之。

以直径10um均匀颗粒的乳剂为较好。

四、对油乳剂苗安全性的评价：1975年在WHO免疫学会上，一个科学工作小组对使用油乳剂苗进行了讨论，认为用矿物油佐剂会引起全身性病状，诱发各种自身免疫紊乱及促进变态反应。

但缺乏充足资料加以证实，尤其缺乏佐剂成分的代谢过程和在动物体内长期毒性及病理学的研究。

现有结果还不能说明他们的推论。

实际在人们接种油苗后的长期观察过程中，尚未发现不良副作用，只有偶然发生局部无菌脓肿的例子。

因而，学者们认为，动物抗体对外来物质总是要发生反应的，注入佐剂也不例外，只是应对反应时间的长短、有害或有利、反应的严重程度等加以分析。

实际上减轻局部反应，还可通过选择更好的材料和最佳乳剂配方来实现。

如前所述，一些学者用精制花生油与化学纯试剂，研制成功“佐剂——65”。

经实验证明，这种佐剂具有矿物油所没有的优点，注射“佐剂——65”两个月后，几乎能完全被代谢，从而可以减少过度刺激，排除了因长期贮留可能产生的有害作用，产生的抗体水平与矿物油佐剂相似。

佐剂——65注射于豚鼠、小鼠及猴，没有发现短期（急性）和长期（慢性）毒性，在家兔体内也没有发现有致畸作用。

虽然曾有人报告皮下注射佐剂——65及矿物油佐剂于小鼠，尤其对雄鼠，长期观察有增生赘生物（瘤），但大量病理学研究表明，这些物质都非致瘤原，而是由于一种已被充分认识的理化改变作用，常见于某些啮齿类动物，与人无关，因为注射蒸馏水，甚至反复穿刺小鼠皮肤，也会发生这种致赘生物作用。

报告还说人体注射矿物油佐剂后18年，注射花生油佐剂10年，随访调查表明，对赘生物的发生并无增加，也没有其他临床上重大的不良反应。

此外，近年来在研究乳剂中还应注意一个问题，即制乳剂苗无论是用矿物油或用花生油，均不能含有脂酶和酯酶，因为，这些酶能使二缩甘露醇及花生油降解，从而释放出脂肪酸。

脂肪酸是有毒性的，会引起注射部位的严重反应，导致形成硬结或脓肿。

应特别注意在用花生油时，必须精制以除去花生蛋白，决不允许含有黄曲霉毒素。

矿物油佐剂的缺点是：①矿物油在组织中因不能代谢而长期存在，造成局部组织损伤；②有污染致癌性多芳香烃化合物的危险，限制了弗氏佐剂只应用于实验动物及一些兽用疫苗。

对乳化佐剂，即水——油——水（W/O/W）乳剂，是将水油剂疫苗再乳化到一种生物学安全的去污剂中（Tween ——80）。

双乳化佐剂与一次乳化佐剂具有同等抗原性而易于吸收，更为稳定，粘性较小，只是在注射部位引起小硬结。

应用甘油、卵磷脂佐剂，由于这种佐剂成分是机体的正常代谢物质，且比佐剂——65更易于乳化，安全有效。

因此，使用花生油、甘油、卵磷脂佐剂对组织无反应性。

一种好的乳剂苗，应该是W/O或O/W型，黏度较低，颗粒大小均匀，稳定性良好，呈乳白色。

作业：试述油乳剂的检验方法。

实习二、仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备目的及要求掌握大肠杆菌灭活疫苗的制备方法；学会对灭活疫苗的检验方法。

内容与方法一、菌种的选择致病性强大的菌种，常常是在疾病流行时自患病动物体内分离的，一般具有良好的抗原性。

当从患病动物分离到病原后，首先须进行纯粹性检验，证明分离物确实不杂有其他微生物，而后进行致病性测定。

如果这种病原能感染实验动物，则应首先在实验动物体上检测其致病力及抗原性，是为初选。

初选入选者在用原宿主动物测试。

在测定病原的致病力时，常常以能致死一半实验动物所需的细菌数来表示，即所谓半数致死量（LD50）。

进行测定时，应当同时设有只接种无菌培养基或生理盐水的阴性对照动物，同时还应设有接种已知致病力的同种微生物的阳性对照动物。

设立阴性对照的目的是为了要阐明所用实验动物是否正常健康，饲养管理是否得当。

设立阳性对照的目的是要阐明被接种动物对接种物的敏感性，以免因实验条件不完善而得到错误的结论。

如果阴性对照发病或死亡，实验不能成立。

如果阳性对照不病不死，说明所用的实验动物不适宜，或存在其他意外干扰因素。

在测定时，将培养物连续递进十倍稀释，将不同稀释度的培养物定量接种一定数量的动物，按被接种动物在规定日期内发病或死亡数计算LD50，以判断接种物的致病力，数字愈小说明致病力愈强。

LD50的计算方法，细菌或病毒培养物进行不同稀释后，各接种小鼠5只，每只接10-7组的积累死亡数=0+2+4+5=11。

而高稀释度的积累生存数是几个低稀释度组的生存数迭加而成。

表中10-10组的积累生存数=0+1+3+5=9。

接种10-8稀释液死亡率为86%，接种10-9稀释液时死亡率为33%，可以想到50%的死亡终点应在10-8——10-9之间，只要将此终点与10-8间的距离比算出即可得到。

所以先计算出此距离比而后计算出LD50的对数，即可求出LD50值，下面是常用的Reed-Muench计算方法。

高于50%死亡率的死亡率-50%距离比=高于50%死亡率的死亡率-低于50%死亡率的死亡率86%-50%=86%-33%LD50值的对数之负数=死亡率高于50%的稀释度的对数之负数+距离比×（稀释系数之间的距离）=8+0.68×1即㏒LD50=-8.68即每0.1ml中含有108.7个LD50，或每1ml中含有109.7个LD50，也就是LD50=10-9.7ml。

通常以对数表示时，仅用小数点后一位数，如本例中LD50=10-9.7，不用LD50=10-9.68。

计算LD50终点时也可以应用Karber氏方法，同样得到准确的结果。

连续稀释系数各稀释度组死亡率之和LD50值的对数=1/2×之间的距离+最低稀释系数之对数-100+86+33 100 =1/2×1+（-7）- =-6.5-2.19=-8.69100即每0.1ml中含有108.7个LD50，或每1ml中含有109.7个LD50，也就是LD50=--10-9.7ml。

在测定时如果不是用10倍系列稀释，则稀释系数之间的距离也必须随之改变，乘以倍数的㏒10的系数。

在2倍系列稀释时这个字为0.301，在5倍系列稀释时为0.699。