乳酸杆菌基因表达系统的研究进展徐义刚1,2,崔丽春1(1.东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040; 2.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030)摘要乳酸杆菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generall y recognized as safe,GRA S)微生物。
乳酸杆菌表达系统是近几年发展起来的一种表达系统,随着乳酸杆菌分子生物学的发展、各类表达调控元件的分离,相继发展了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体和整合载体。
乳酸杆菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力,以乳酸杆菌为载体,作为外源基因的传递和表达系统,研制口服疫苗,刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答,具有重要开发前景。
关键词乳酸杆菌;外源基因;表达系统中图分类号Q939.11+7文献标识码A文章编号1005-7021(2007)03-0087-05Progress on G ene E xpressi on Syste m of Lact obacill usXU Y-i gang1,2,C U I L-i chun1(1.N ort h e a stF orest ry Univ.H arbin150040;2.C oll.of Veteri nary M e d.N ort h e a st Agric.Un i v.H arbi n150030)A bstrac t Lactobacill us is a k i nd o f i m portant prob i o ti c i n gastro-i ntesti nal tracts o f hu m an and most an i m a l s,and t hey are conside red to be safe bacter i a w it h a GRA S(generall y regarded as safe)status.T he express i on syste m s o f Lactobacillus is a k i nd of expression sy stem tha t have been deve l oped i n recent yea rs,and as t he deve l op m en t of mo-lecu l ar b i o l ogy o f Lactobacillus,and the sepa ration o f var i ous expressi on regu l a t o ry ele m ents,t he c l on i ng vector,the expressi on vector,and the i ntegrati on v ector have been deve loped one a fter ano t ctobacillus possesses many properties such as i m mune ad j uvant,adsorpti on mucosa,ant-i b ile ac i d capab ili ty;take Lactobacillus as a vector trans-fero r and expressi on syste m s o f exogenous gene to study ora l vacc i ne,sti m u l ate mucosa i m m une syste m to produce e-f fecti ve i m mune responses,a ll o f these possess i m portant deve l op m ent prospect.K eywords Lact obacillus;exogenous gene;expressi on syste m乳酸菌(Lactic ac i d bacteria,LAB)是人及动物肠道中极为重要的益生菌群之一,该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌,是乳品工业发酵的重要菌类,是在食品、医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。
20世纪80年代,人们开始致力于乳酸菌生物学性质和分子机制的研究,乳酸杆菌在农业、食品领域所具有的重大经济意义及对人体和动物健康的重要性,越来越引起人们的关注。
随着乳酸杆菌分子生物学的发展和电转基因技术的建立,以及各类表达调控元件的分离和克隆,已经建立和发展了一系列乳酸杆菌基因表达载体和传递系统,为探索其新的应用潜力提供了基础,其中利用乳酸杆菌作为抗原传递载体进行粘膜疫苗免疫的研究,是该领域研究的前沿和热点。
本文主要对乳酸杆菌表达系统方面的进展作一综述。
1乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌的优势乳酸杆菌作为主要的益生菌广泛应用于食品及饲料加工业,在功能食品、医疗保健、微生态制剂等领域的应用具有诱人的前景[1]。
目前,乳酸杆菌制剂已被应用于肠道的微生态治疗[2]。
乳酸收稿日期:2006-09-19作者简介:徐义刚男,博士。
从事病原微生物与免疫学研究。
87微生物学杂志2007年5月第27卷3期J OURNAL OF M ICROBIOLOGY M ay2007V o.l27N o.3杆菌另一个在医学领域具有应用潜力的是作为免疫接种的疫苗载体[3~5]。
乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌,其优越性主要表现在:¹乳酸杆菌能在呼吸系统、消化系统[6]、泌尿系统定植,对维持微生态平衡具有重要作用;º在食品工业各个领域中长期应用已证实不具有致病性,被公认为安全级(GRAS,genera ll y recognized as sa fe)微生物,身为食品级细菌,易构建成食品级的基因克隆及表达系统,可以有效提高基因工程产品的安全性,并可在一定程度上简化表达产物的后期处理工艺;»具有控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能[7];¼同肠胃外免疫途径相比,通过黏膜免疫,可以诱发I g A产生;½具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及对胆汁酸的抵抗力。
因此,乳酸杆菌作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔。
2乳酸杆菌质粒乳酸杆菌的许多种类中均发现有质粒的存在,且多种乳酸杆菌均具有1个或多个质粒谱。
用DNA-c DNA杂交和核苷酸序列分析证实,各种质粒之间具有不同程度的同源性,从而说明质粒间的横向传递和重组是相当频繁的。
最近几年开展了有关质粒与细菌特性关系的研究,发现质粒与某些表型,如抗药性、N-乙酰氨基葡萄糖减缓酸的形成、糖苷的代谢、糖代谢、氨基酸代谢、细菌素产生与免疫等密切相关。
大多数乳酸杆菌质粒表现出分离稳定性,尤其是小的隐性质粒较大质粒相对更加稳定。
经研究表明乳酸杆菌质粒具有如下特点:¹大多数乳酸杆菌质粒均为隐蔽型质粒,但已证明某些乳酸杆菌的细菌素、糖代谢有关的酶及抗生素抗性等都是由不同质粒所决定的;º乳酸杆菌质粒具有遗传稳定性;»乳酸杆菌中小型质粒拷贝数高,一般可达30~50个;¼部分乳酸杆菌质粒复制子宿主范围广泛,可在其他种类的革兰阳性菌及大肠杆菌中发挥作用,避免了专一性质粒在不同菌株之间使用时不必要的亚克隆;½乳酸菌属的某些菌株的质粒也可作为乳酸杆菌的质粒,如由宿主范围广的乳酸球菌质粒pGK12构建出的乳酸杆菌基因转化系统;¾某些乳酸杆菌质粒没有宿主特异性,如pLP501、pLPE323适用于广泛宿主范围,可在不同种类乳酸杆菌中增殖,而且它们的扩增拷贝数没有明显不同,这说明其在不同宿主菌中DNA复制调控机制是相似的。
表1列出了从乳酸杆菌中分离的质粒及构建的质粒。
表1乳酸杆菌中分离及构建的质粒Tab le1S egregat ed and constru cted p l as m i ds fro m Lac t obacill us菌种分离质粒构建质粒L b.re u teri pGT232pNCK HpTE80/15pUE80L b.h i gard ii pLAB1000pLABpL AB2000L b.plantarum p8014-2pLPL b.fe rm e n t um pLE M3pLEM7、pLEM415pLF1311pLF9/14L b.pe n tosu s pLP3537pLPEW1/2、pLPE323/317p353-2pLPE323/350L b.he l ve tic us pLJ1PLHR、pBG103乳酸杆菌质粒基因表达调控随着乳酸杆菌分子生物学及基因工程技术的发展,已分离出了乳酸杆菌的各种表达调控元件,对乳酸杆菌基因转录和翻译调控及蛋白质分泌机制有了进一步的了解,并通过对部分质粒DNA序列的测定,然后同已知序列质粒的基因进行比较来推测未知质粒基因功能的途径,相继开发出了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体、整合载体[8]。
研究发现乳酸杆菌质粒基因中普遍存在两种调控序列,一种是与基因复制起始相关的序列,主要包括两大类:一类是编码蛋白的开放阅读框架ORF,在乳酸杆菌中与质粒复制相关的ORF之间存在同源性。
另一类是与调控有关的非编码序列,主要包括复制相关蛋白作用的靶序列、正-负向复制起始点、缺失位点、启动子等复制调控元件。
其中乳酸杆菌的启动子对LAB具有高度的选择性[9],故在LAB表达系统中,很少使用外源启动子,目前已成功用于表达外源蛋白的启动子有lac A、lac R、lacF、T7、xy l A、lacS、n is A/n isZ、nisF、usp等,这些启动子的诱导物都是食品级的,如乳糖、木糖和N isin等,易于构成食品级LAB表达系统,提高转基因LAB工程菌株的安全性;另一种88微生物学杂志27卷是控制质粒拷贝数和不相容性的DNA序列。
质粒的拷贝数是由DNA非编码序列中的重复序列和反转录RNA来控制的。
除pLJ1外,所有质粒都有与革兰阳性杆菌质粒复制蛋白(Rep)相似的一种蛋白,根据复制蛋白的功能特性,及和其他质粒复制蛋白结构相似性,推测乳酸杆菌属的小质粒是以滚环(RCR)方式进行复制的,可产生单股DNA中间体的积累[10]。
因此具有滚环复制所必需的复制启动元件,这些结构包括正-负复制起始点、复制控制元件和移动元件等,这些序列或元件与其他源于革兰氏阳性菌的质粒的相应区域的广泛的同源性,推测乳酸杆菌质粒的这些序列或元件是通过基因内或基因间传递机制而获得的。
4乳酸杆菌质粒的选择性标记传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素等)抗性的基因,如果将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内,由于抗性因子的转移,将带来生物安全性的严重后果。