利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶 固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类 热点：固定化原生质体的应用
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2． 固定化酶在医药治疗上的应用


例1
固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就
可以生成不同的产物。
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青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
H2N R1
O
R2
+
NH2 O N O
S
Penicillin G acylase H2O R

利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一 性，可逆结合而设计的纯化方法

是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方
法
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5． 固定化酶与环境保护

一：环境监测 二：污染物处理。
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6． 新能源开发中的应用

H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2， 但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢， 稳定性比天然细胞好。
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影响吸附法的主要因素

（1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大
小

（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质

（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料
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包埋固定法

包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情 况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固 定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多
苷酸从而推导出序列

——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷 酸化酶，荧光酶柱
1
OH
NH2 H N S O N O O OH
1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe
的薄层，用紫外照射3min，就可制得
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固定化细胞的目的

微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩
短了发酵生产周期

植物细胞 动物细胞
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第四节固定化细胞提要

特点 方法


目的
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第四节结束

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第五节 固定化原生质体和辅酶


一 原生质体的制备 二 固定化 三 举例 四 辅酶固定化
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
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酶促合成头孢类抗生素
（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞
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通过改变载体溶液参数包埋细胞

改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和
溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态， 将细胞包埋其中。
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研究热点——光交联树脂包埋法

例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等， 加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃， 然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h 营养要求 光照要求 植物细胞 20-300 >12 简单 大多数要光照 微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求
对剪切力
敏感
色素、药物、香 精、酶等
大多数不敏感
醇、有机酸、氨基 酸、抗生素、核 苷酸、酶
敏感
疫苗、激素、 抗体、酶
反应－分离耦合反应器成功实现产物在线分 离
Concentration (mmoldm-3)
60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 Time (h) 10 12
7ACCA without ISPR cefaclor without ISPR 7-ACCA with ISPR cefaclor with ISPR
减压式反应器用于生物催化反应中易挥发产 物的在线去除
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Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransformation, 2003,21(3)135-139.
生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯
常规反应器用
减压式反应器用
二．固定化酶（细胞）的应用

主要产物
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固定化细胞的特点


类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞
生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 最多使用：颗粒状珠体 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以长期使用。
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一 原生质体的制备

将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压
稳定剂的高渗缓冲液中——加入水解酶——分 离——得到原生质体
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二 原生质体固定化的方法

将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体
重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成 一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制 成固定化原生质体。
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生物催化反应－分离耦合反应器
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Diagram of the enzymatic synthesis of cefaclor with in situ product removal. (1) Complexation reactor, (2) enzymatic reaction reactor, (3) peristaltic pump, (4) sintered-glass (G2), (5) mechanical stirrer.
1.
固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用
2． 固定化酶在医药治疗上的应用 3． 固定化酶在分析化学中应用 4． 固定化酶和亲和色谱 5． 固定化酶与环境保护 6． 新能源开发中的应用 7． 固定化酶在基础理论研究中应用
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1． 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用


葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。
酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。
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包埋法分类

常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺

常用凝胶包埋法
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举例海藻酸钙包埋法

基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀 菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀， 然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中
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1． 分批搅拌反应器

反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小 规模试验
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2． 连续流搅拌桶反应器
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连续搅拌釜式反应器
3． 连续搅拌桶-超滤反应器
酶循环
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4． 填充床反应器

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旋转填充床
5． 循环反应器

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高效内循环生物反应器（HCR）
6． 流化床反应器

与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒
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四 辅酶固定化

1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应


有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生
有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
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辅酶固定化的方法：

2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法
以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修
Enzyme Engineering 酶工程
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第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞） 的应用

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第四节 微生物、植物和动物细胞固定化

细胞特性比较

将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜
包被，可用于水的光介产生氢气和氧气
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7． 固定化酶在基础理论研究中应用

阐明酶反应机理
揭示酶原激活机理
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酶亚基性质的研究
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研究蛋白质-核酸分子结构

连续的固定化酶柱进行DNA序列分析 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释放的焦磷 酸判断是否发生了聚合反应，进而确定掺入的是哪种核
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概念：

固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细
胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新 陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。
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细胞固定化方法

吸附法
包埋法

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酶和细胞固定化示意图
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吸附法

它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载 体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞 固定在载体上的。
饰后固定在超滤器中。

3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。
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辅酶的固定化
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辅酶的固定化
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辅酶固定化的形式：
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第五节 固定化原生质体和辅酶的固定化
原生质体