一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。

2、载体选择取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。

分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。

根据其酶活和得率进行筛选。

３、固定化条件的优化取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。

处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。

4、蛋白质含量测定采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。

5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。

6、酶活测定以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。

在60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。

以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。

二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。

其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。

大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。

2、脂肪酶的固定化采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。

称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环泵中,搅拌器搅拌反应 24h。

过滤,测定上清液的蛋白质含量。

抽滤分离固体和上清液,并用同种缓冲液清洗该固定化酶,自然风干,收集后保存待用。

三、D380树脂固定果糖基转移酶1、树脂的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替处理，最后用蒸惰水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馆水浸泡胀润、去杂，然后用 4% HCl 、4% NaOH 交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性，置于 4°C 冰箱保存备用。

2、游离果糖转移酶提取方法黑曲霉 AS0023细胞的制备见参考文献 [12J 。

称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中，加入适量的 0.05moI/ L ， pH5.0 的拧棱酸一磷酸缓冲液，在冰浴环境中用超声坡细胞破碎仪处理一定时间后，于 4°C 下冷冻离心( 10000 * g) 20min ，收集上清液在 4°C 条件下进行超滤以提高单位酶活，压力 0.15MPa ，截留相对分子质量 10000 ，粗酶提取液放入冰箱保藏备用。

3、果糖转移酶的固定化方法用滤纸吸干温树脂表面的水后称取 0.5g 于三角瓶中，加入一定量的酶液，在所需的 pH 下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间后，加入一定量的戊二醒进行交联。

交联完成后，弃去上清，用缓冲洛液冲洗戊二醒残留及未固定上的游离酶，所得固定化酶用缓冲液漫泡待用。

4、酶活测定方法游离果糖基转移酶活测定:一定体积底物浓度为 10% (w/v )0.05moI/ L 、 pH5.0 的拧穰酸-磷酸缓冲液于直径 50mm ， 100mL 的恒温夹套酶反应器中， 50°C下恒温搅拌反应 1 h ，于 1弗水中煮沸lO min 终止反应。

5、惰组分测定方法采用 HPLC( 高效液相色谱)法。

HPLC , Waters 209 系列，配有R401 示差折光检测器和M740 数据处理器;色谱柱: Hewlett Packard 公司 APS Hypersil 4.6 * 100mm 填料密度5μm; 流动相:乙睛/水 75/25 ，流速 1mLl min; 强度28 ℃;进样量 :10μL 。

6、酶活力定义每分钟产生 1μmol 在果三糖( 1-kestose )为一个酶活力单位。

酶用量为 2U/g 蔗糖。

固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的测定方法。

固定化酶活回收率:酶活回收率定义为固定化酶活与所添加的总酶活的比值。

四、Burkholderic cepecia 1003 产海因酶固定1、海因酶的制备将由本实验室的一株 Burkholderic c叩ecia 10.03 菌株发酵产酶经过细胞破碎、硫酸镣沉淀、疏水层析和离子交换层析等步骤后得到经初步纯化的海因酶酶液。

蛋白质量浓度为1. 2 mg/ mL ，于- 2.0°C下保存备用。

2、 Eupergit C 和 Eupergit C250L的氨基化分别称取 5 g Eupergit C 和 Eupergit C250L干树脂，于密闭容器内，45 °C下分别用 4.0 mL 2.5% 的NH3• H20 浸泡.48 h ，以去离子水反复淋洗至中性。

以 pH 6.5 , 0.1 mol/L 的磷酸缓冲平衡氨基化后的树脂，于4 °C下保存备用。

3、 EDC 溶液的配置称取0.785 g EDC( 碳化二亚胶 (N 一( dimethyl-aminopropyl) - N’- ethylcarbodiimide) ) ，加入 5 mL MnC1 2 水溶液 (1 mmol/L) 中，用 1%HCl 调节 pH 值至 5.0，定容至 12 mL 。

4、环氧基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出2mL分别加人0.2 g 的环氧基载体 Eupergit C 和Eupergit C250L 湿树脂。

4°C 下水平轻微振荡后，用pH 8.5 , 0.1 mol/L 的 Tris - HCl 缓冲滤洗，4°C下至少保存48 h后方可使用。

5、氨基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出 2 mL 分别加入0.2 g 的氨基载体 Eupergit C ( -NH2) 和Eupergit C250L( -NH2 )湿树脂，冰浴条件下手动振荡滴加 EDC 溶液， 4 °C下悬空振荡。

反应结束后，需用含0. 5 mol/L NaCl 的 pH 8.5 , 0.1 mol/L 的Tris - HCl 缓冲反复淋洗 3 次，最后用pH 8. 5 , 0.1 moVL 的 Tris - HCl 缓冲滤洗后 4°C保存。

五、黑曲霉果胶酯酶固定化1、游离酶活力的测定J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kerte钮， 1937 )测定果胶醋酶的活力。

取100mL 质量分数为 0.5% 的柑桶果胶溶液于 40 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到 4 .4，加入lmL 酶液(稀释 10 倍) ，同时开始记时。

果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人 O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在4 .4。

每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应5min ，以加人的NaOH 的微摩尔数一反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。

1 个酶活单位 :40 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即PE 活力单位是μmol/min 。

2、固定化酶活力的测定J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kertesz , 1937) 测定果胶醋酶的活力。

取100mL 质量分数为 0.5% 的柑情果胶溶液于 45 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到固定化果胶醋酶的最适 pH( 明胶固定化果胶醋酶为 4.0 、蛋壳固定化果胶醋酶为 4.2) ，加人一定量的固定化果胶醋酶(明胶固定化果胶醋酶为 8g 、蛋壳固定化果胶醋酶为 1g) ，同时开始记时，果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在固定化果胶醋酶的最适 pH 。

每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应 5min ，以加人的 NaOH 的微摩尔数反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。

1个酶活单位: 45 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即 PE 活力单位是μmol/min。

3、固定化酶的制作方法蛋壳固定化酶的制作方法蛋壳的预处理取用水浸泡了一段时间的蛋壳，揭除内层薄膜，研成小片。

用去离子水彻底清洗后，用蒸馆水洗涤，再用丙酣溶液洗涤，所得蛋壳碎片于干燥箱内 60 °C干燥数小时，研成小颗粒，待用。

蛋壳的酸处理称取与预处理好的蛋壳于100mL 烧杯中，向其中缓慢加人 50mL pH = 1. 0 的拧攘酸，以缓解蛋壳的强碱性质，拧攘酸处理 24h ，最终pH =4 。

固定化酶的制备称取 1g 酸处理后干燥的蛋壳，加入 9mL 乙酸-乙酸铀 (pH = 4.5) 缓冲液，再加入稀释 10 倍的黑由霉果胶醋酶 lmL( 酶活力60U) ，在 4°C (冰水温合物中)搅拌 2-3 h，使其充分吸附在蛋壳上。

之后对其进行离心 (4 °C , 5000*g , 20min) ，得到的离心沉淀产物即为固定化果胶醋酶，用乙酸一乙酸铀 (pH4.5 )缓冲液洗涤数次，放在冰箱中 (4 °C)保存备用。