启示神经与基于BSC疗法的导电材料的接口：通过偶合石墨烯加速神经干细胞的生物电功能开发为了管理在组织工程细胞特异性行为神经修复和再生，更好地理解材料- 细胞相互作用，尤其是生物电功能的，极其important.Graphene已报道是用作支架的潜在候选和神经interfacingmaterial.However，石墨烯这些导电性基板细胞膜的生物电演变在很大程度上仍然没有进行过。

在这项研究中，我们使用了神经干细胞（NSC）模型，探讨膜生物电属性E包括增殖和分化conditions.We下休息膜电位和动作电位E和细胞行为上的石墨烯薄膜中使用的组合可能发生的变化单细胞电生理记录和传统的细胞生物学技术。

石墨烯不影响基本膜电参数（电容和输入电阻），但搁在石墨烯衬底细胞膜电位分别更强烈增殖和分化的条件下为负。

此外，神经干细胞及其对石墨烯基片表现出的后代与对照相比，在开发过程中增加的动作电位的射击。

但是，石墨烯只有轻微影响电动刻画ofmature NSC后代。

石墨烯基片上的被动和主动的生物电特性Themodulation伴随着增强NSC分化。

此外，棘密度，突触突触蛋白表达和在.Modeling石墨组所有activitywere增加上导电的石墨烯衬底电场表明由该负电的细胞膜产生的电场大于上即控制它的石墨烯衬底高得多，这可以解释观察到的通过耦合石墨烯的生物电的发展变化。

我们的研究结果表明石墨烯是能够加速在开发过程中的NSC成熟，特别是在生物电发展方面。

我们的发现提供对导电材料在调谐膜中的作用的基本理解石墨烯模型中的生物电性能，为未来的发展研究铺平道路方法和材料形成在基于NSC的治疗的可控通道中的膜性质。

石墨烯，碳原子的2维单层，由于材料的独特的电，机械和热特性，一直在纳米技术的最前沿。

它最近被认为是一个有前途的候选人制造超快纳米电子器件，透明电极，纳米复合材料和生物医学材料[3]。

它已经用于多种生物医学应用，包括细胞成像和药物递送[4]，生物分析[5]，干细胞研究[6,7]，甚至光热疗法治疗肿瘤[8]。

最近，我们和其他团体发现使用石墨烯作为神经接口材料的可能性，因为它可以促进人类成神经细胞瘤（SH-SY5Y）细胞培养[9]，PC-12细胞[10]，海马原代培养神经元[11]和直接NSC分化神经元[12,13]，促进神经干细胞分化成石墨烯纳米网半导体神经元和形成神经元纤维[14,15]。

此外，越来越多的研究表明石墨烯表现出操纵茎的命运的潜在能力细胞。

例如，石墨烯基材料能够诱导NSC分化成神经元谱系[7,16]，控制甚至加速间充质细胞的分化干细胞[6,17e22]，并调节其他类型的行为干细胞，包括多能干细胞和胚胎干细胞[23e25]。

这些开创性的研究清楚地证明了在细胞治疗中基于石墨烯的材料的巨大潜力。

然而，改变细胞行为背后的基础机制，例如增强的分化和促进的细胞增长，仍然很大程度上未知。

细胞功能和细胞之间的强连接膜的生物电性质启发我们调查石墨烯是否可以调节NSC发育和成熟的子代通过影响其生物电特性细胞。

在这项工作中，我们研究了石墨烯的影响在NSC 发育期间电生理状态的成熟，包括被动和主动生物电特性和随后的NSC命运的选择。

2。

材料和方法2.1。

石墨烯膜制备根据先前公布的CVD方法[26]合成石墨烯样品。

简言之，将薄铜箔（5cm×5cm）加热至1000℃并在H 2和Ar气体下退火20分钟，随后暴露于H 2和CH 4下5分钟。

然后在H 2和Ar气下将膜从1000℃冷却至室温。

通过在硝酸铁水溶液中蚀刻从铜箔上除去石墨烯膜。

在铜膜溶解之后，使TCPS基板与石墨烯膜接触，并将其从溶液中拉出以制造石墨烯/ TCPS基板。

石墨烯/ TCPS基底用室安装，并浸没在milli-Q水中过夜以除去任何残留的可溶性有毒组分。

在用75％的醇灭菌后，石墨烯/ TCPS基板连续浸泡在无菌PBS缓冲液中并用PBS中的层粘连蛋白溶液（20mg / ml，37℃过夜，Sigma，USA）包被。

在细胞接种之前，将石墨烯膜在增殖培养基中浸泡过夜。

2.2。

石墨烯基板的表征石墨烯的透射率用UV / Vis测量光谱仪（LAMBDA 25，PerkinElmer，Singapore）。

玻璃显微镜将载玻片切成0.9cm 2的矩形。

2.6厘米以适应样品架。

使用空白载玻片作为参考每次测量。

结晶度和层数存在于石墨烯内通过拉曼光谱法检查（lamRAM HR800，HORIBA，France）和TEM（Tecnai G2 F20 STwin，FEI，USA）。

石墨烯的表面形态TCPS通过AFM（Dimension 3100，Veeco，USA）使用测定在室温下操作的轻敲模式。

表面化学的石墨烯膜通过XPS（Axis Ultra DLD，Kratos，UK）与在40eV操作的AlKαX射线源。

的通过扫描检查石墨烯膜的形态电子显微镜（SEM）（Quanta 400FEG，FEI，USA）。

2.3。

NSC培养在增殖和分化条件下NSCs来源于海马的两个半球的出生后第1天ICR大鼠（SooChow大学动物中心）。

将海马与血管和脑膜分离并在Falcon管中在Hank平衡盐溶液中收集（HBSS）在4℃，然后用HBSS 漂洗两次。

离心后（1000rpm，5分钟），将组织在TryplE（LifeTechnologies，USA）在37℃下孵育15分钟，然后机械地轻轻研磨通过使用移液器吸头。

将NSCs悬浮于DMEM-F12中含有2％B-27的培养基中，并在潮湿气氛中培养用5％CO 2在37℃。

进行NSCs的传代每7天培养。

对于增殖研究，NSCs接种浓度为5μg/ 104细胞/ mL其由补充了2％B-27的DMEM-F12培养基组成与20ng / mL EGF和20ng / mL FGF-2（R＆D Systems，美国）。

对于分化研究，NSC以相似的方式接种浓度在含有2％B-27的DMEM-F12培养基中与胎牛血清（GIBCO，USA）和1mM视黄酸（Sigma）。

在这些实验中动物的护理和使用遵循由护理和使用批准的指导方针和协议东南大学动物委员会。

所有的努力使所使用的动物数量和他们的痛苦最小化。

2.4。

免疫荧光用PBS洗涤细胞，在4％多聚甲醛中固定45分钟，在含有2％BSA的PBS中封闭，并用透化0.1％triton X-100，90分钟。

将细胞与原代培养抗体孵育90分钟，然后与第二抗体温育持续60分钟，然后进行DAPI染色。

抗体小组包括针对GFAP的一抗，Ki67（Abcam，USA），Tuj-1，O4，微管蛋白，纽蛋白（Sigma）和TREK-1（Santa Cruz Biotechnology，美国）。

对于成像树突棘，细胞已被转导与编码mCherry-肌动蛋白的慢病毒。

pLVX-mCherryactin载体（Clontech，USA）用于包装慢病毒。

细胞在DIV 21成像。

2.5。

基于WST的细胞增殖测定WST-8 [2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺苯基）-2H-四唑鎓单钠盐]色度测定法根据Cell Counting Kit-8（Dojindo，Japan）。

简言之，10％（v / v）CCK-8溶液在指定的时间点加入培养基中并在培养箱中孵育细胞4小时。

然后，200mL的最终溶液转移到96孔板中使用酶标仪在波长λ下测量吸光度450nm。

2.6。

RNA提取和RT-PCR进行RNA分离，逆转录和PCR分析按照标准方案进行。

简言之，总细胞RNA使用TRIzol 试剂（Life Technologies），1mg RNA分离使用TaqMan Reverse Transcription Reagents进行逆转录（Applied Biosystems），和所示的mRNA水平使用SYBR Green主混合物一式三份分析基因（Applied Biosystems）和Chromo-4实时RT-PCR仪器（MJ Research）。

将mRNA水平标准化为GAPDH（内部对照）和基因表达呈现为倍数变化（DDCt法）。

2.7。

免疫印迹用在0.03％EDTA中的0.25％胰蛋白酶收获细胞并裂解在RIPA缓冲区。

将收集的蛋白质样品装载在10％聚丙烯酰胺凝胶，通过凝胶电泳分离并转移到PVDF膜（Millipore，USA）上。

将细胞孵育与针对巢蛋白的多克隆一级抗体（1:400，Sigma），TREK-1（1:500，Santa Cruz Biotechnology），突触泡蛋白（1:400，Millipore）或PSD-95（1:400，Abcam，USA）和次级抗体（Santa Cruz Biotechnology）。

然后膜与ECL western印迹底物试剂盒（Pierce，USA）反应曝光。

GAPDH用作内部对照。

2.8。

电生理记录将补片移液管从硼硅酸盐玻璃毛细管中取出（1.2 / 1.5mm：ID / OD），并用含有移液管溶液填充120mM CsCl，20mM四乙基氯化铵，2mM MgCl 2，10mM EGTA，2mM ATP二钠，和10mM HEPES电阻3e4 MU。

记录溶液由156mMNaCl，4mM KCl，1mM MgCl 2，2mM CaCl 2，10mM HEPES，10mM葡萄糖，pH 7.25（用KOH调节）。

获得常规的全细胞膜片钳记录用Axopatch 1-D（Molecular Devices，USA）。

在此期间电压钳位，保持电位设定为〜64mV。

无补偿串联电阻值<8e12MU。

在此期间电流钳记录，电桥平衡连续监测和调整。

密封不良的细胞或那些丢弃15e30MU范围之外的串联电阻。

对于VR记录，石墨烯和TCPS上的细胞样品每天记录。

记录AP至少7分钟后膜破裂。

通过具有上升速度来鉴定AP超过50mV / ms并且根据全或无代。

刺激阈值是最低强度刺激所需的诱导AP。

这是由200毫秒确定的电流步长（10e150 pA，10epA增量）。

振幅（从基线到峰值）和持续时间（在20mV以上测量阈值）。

检查重复AP点火，一串强度为40 pA的1 s电流高于刺激阈值，并注射细胞的反应记录。

对于自发性突触后电流（sPSC）记录，在〜70mV的保持电位下记录sPSC使用EPC-9放大器（HEKA，德国）。

所有信号都被数字化在10kHz下，在2kHz下过滤，存储在计算机硬盘上，并用Igor Pro 4.05软件（Wavemetrics，美国）。

2.9。

数据分析数据表示为平均值±SEM。

通过分析数据双向或单因素方差分析，然后进行Tukey's事后检验。

Ap值小于0.05被认为是显着的。