The Process of DNA Replication
一、原核生物的DNA生物合成
（一）复制的起始
需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。
2. 合成引物，提供3-OH末端。
1. DNA解链
1 13 17 29 32 44 GATTNTTTATTT · · · GATCTNTTNTATT · · · GATCTCTTATTAG · · ·
• 它参与DNA损伤的应急状态修复。
DNA-pol Ⅲ
(250kD)
功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。
（二）真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。 参与低保真度的复制 。 在线粒体DNA复制中起催化作用。 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。
（二）真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol 分子量（kD） 5→3聚合活性 3→5核酸外切 酶活性 功能 α 16.5 中 起始引 发，引 物酶活 性 β 4.0 ？ 低保 真度 的复 制 γ 14.0 高 + δ 12.5 高 + ε 25.5 高 + 填补引物 空隙，切 除修复， 重组
N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶
C端
小片段
323个氨基酸 5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 • Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
DNA-pol Ⅱ（120kD）
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。
邻的DNA链连接成一条完整的链。
5’
O
3’
3’
O P OO-
HO
ATP
5’
DNA连接酶
ADP 5’ 3’ 3’
O O P OO-
5’
目录
•功能
• DNA 连接酶在复制中起最后接合缺口的
作用。
• 在 DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺 口作用。 • 也是基因工程的重要工具酶之一。
第三节
DNA生物合成过程
二、DNA聚合酶
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNAdependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol
活性：1. 53 的聚合活性
2. 核酸外切酶活性
• 核酸外切酶活性
5´
AG C T T C A G G A T A

3´
| | | | | | | | | | |
C. 复制接近终止点(termination, ter)
真核生物每个染色体有多个起始点，是多
复制子的复制。
习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为
一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复
制的功能单位。
5’ 3’
ori
ori
ori
ori
3’ 5’
5’ 3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
复制子
三、复制的半不连续性
复制的方式
——半保留复制(semi-conservative replication) 复制的高保真性(high fidelity)
双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication)



一、半保留复制的实验依据和意义
拓扑异 构酶Ⅱ
切断DNA分子两股链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。
目录
五、DNA连接酶
• DNA连接酶(DNA ligase)作用方式
连接 DNA 链 3-OH 末端和相邻 DNA 链 5-P
末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相
E. Coli 基因图
• 解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链 解开成为两条单链 • 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA引物的酶 • 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单 链的完整
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
（二）复制的延长
复制的延长指在 DNA-pol 催化下， dNTP 以 dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上， 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。
3' 5'
母链DNA
复制过程中形成 的复制叉
子代DNA
目录
• 子链继承母链遗传信息的几种可能方式
全保留式
半保留式
混合式
• 密度梯度实验
含重氮-DNA的细菌
培养于普 通培养液
梯度离心结果
第一代
继续培养于 普通培养液
第二代 ——实验结果支持半保留复制的设想。
• 半保留复制的意义
按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA
DNA-pol
OH 3'
5' 3'
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
dCTP
dATP
dGTP
dTTP
目录
领头链的合成
目录
随从链的合成
目录
目录
阶段一
阶段二
阶段三
阶段四
复 制 过 程 简 图
目录
复 制 过 程 动 画
（三）复制的终止
• 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制 片段在复制的终止点(ter)处汇合。
（一）复制的起始
• 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子 复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活 而不是同步起动。 • 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子 (replication factor, RF)。
• 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。
第 十 章
DNA的生物合成 (复制)
DNA Biosynthesis，Replication
复制(replication)
是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板 合成子链DNA的过程。 复制 亲代DNA
子代DNA
第一节
复制的基本规律
Basic Rules of DNA Replication

DNA-pol I DNA-pol II 分子量(kD) 组成 分子数/细胞 5→3核酸外切酶活性 基因突变后的致死性 109 单肽链 400 有 可能 120 ？ ？ 无 不可能 DNA-pol III 250 多亚基不对称 二聚体 20 无 可能
DNA-pol Ⅰ
（109kD）
功能：对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。
A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用 其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。
（二）复制的保真性和碱基选择
• DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键） 与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 • 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应 的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。
3
5 3
领头链 (leading strand)
解链方向
随从链 (lagging strand)
5
• 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，
这股链称为领头链。
• 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能 顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称 为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段 (okazaki fragment)。
5 3
串联重复序列 反向重复序列
3 5
· · · TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA
58
66
166
174
201
209
237
245
E.coli复制起始点 oriC
2. 引发体和引物
Dna B、 Dna C Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 3
DNA复制的保真性至少要依赖三种机制
1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。
四、复制中的分子解链及DNA 分子 拓扑学变化
DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA解成单链，它才能起模板作用。
（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
• 3 5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 • 5 3外切酶活性 能切除突变的 DNA片段。
目录
（一）原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ
DNA-pol Ⅱ
DNA-pol Ⅲ
（一）原核生物的DNA聚合酶
• 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制
的半不连续性。
第二节 DNA复制的酶学
The Enzymology of DNA Replication
•参与DNA复制的物质
底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol