・实验研究Experimental R esearch ・葡萄籽原花青素的梯度分离及其抗氧活性研究3Studies of G radient Extraction of G rape Seed Proanthocyanidin and Their Anti 2oxidative Effects杨怀霞Yang Huaixia 1,马庆一Ma Qingyi 2,许 闽Xu Min 11.河南中医学院Henan College of Traditional Chinese Medicine ;2.郑州轻工业学院Zhengzhou Institute of Light Industry摘要:目的:研究葡萄籽原花青素的梯度分离方法及各组分的抗氧化性能。
方法:葡萄籽样品通过乙醇粗提后,用不同溶剂梯度分离得到各组分,以乙酸乙酯组分为代表确定DPPH ・法测定活性的最佳浓度范围,再比较各组分自由基淬灭能力。
结果:最佳活性测定样品浓度范围1.0～10μg/ml ,运用此法测得的清除率在25%～80%之间,灵敏度和准确度较高;葡萄籽梯度分离各组分清除自由基能力:乙酸乙酯组分≥丙酮组分>乙醇组分>乙醚组分>乙醇粗提物>二氯甲烷组分>石油醚组分;其中乙酸乙酯组分和丙酮组分活性尤其突出,表明有高活性成分富集其中。
结论:梯度分离葡萄籽原花青素提取物的效果令人满意。
Abstract :Objective :To explore gradient extraction of grape seed proanthocyanidin and their antioxdative effect.Method :After sam 2ple grape seeds were extracted with ethanol ,the active components were obtained by application of different organic solvents.Through investigation of the free 2radical scavenging effect of ethylacetate components ,the optimum concentration range was deter 2mined by DPPH method and a comparison was made on the antioxidative effects of the different components from grape seeds.Re 2sult :The optimum assay range was 1.0～10ug/ml with the scavenging rate between 25%～80%.The sensitivity and accuracy of this method were satisfying.The free 2radical scavenging effects of different components from grape seed proanthocyanidin came in the following :Ethyl acetate >Acetone >Ethanol >Ether >the primary extracts of ethanol >Dichloromethane >Petroleum ether.A 2mong all components ,the activities of Ethyl acetate and Acetone extracts were excellent marked by the active components highly con 2centrated.Conclusion :Gradient extraction of grape seed proanthocyanidin was very promising.关键词:葡萄籽;梯度分离;抗氧化性;DPPH ・法K ey w ords :grape seed ;gradient extraction ;anti 2oxidative effect ;DPPH method中图分类号CLC number :R284.2 文献标识码Document code :A 文章编号Article ID :1672-6839(2004)05-0014-03 许多生理、病理现象都与体内自由基的产生和积累密切相关,寻找阻遏自由基反应的抗氧化剂的工作格外重要[1]。
近年来,植物源抗氧化剂由于其低毒、高效成为研究热点,葡萄籽中提取的原花青素更因其独特的抗氧化特性及高生物利用率倍受青睐,但因其组成复杂,各类成分之间性质相近,难以分离,极大地影响了有效成分的开发利用[2]。
DPPH ・法简便、快速、重现性好,广泛用于各种自由基清除剂筛选研究的分析跟踪[3]。
本文以梯度提取方法分离葡萄籽中的有效成分,以乙酸乙酯组分为代表确定DPPH ・法测定活性的最佳样品浓度范围,并对比了各组分的自由基淬灭能力,即其抗氧化活性的强弱。
该研究方法简便、有效,既为葡萄籽提取物的开发应用提供理论依据,也为其它同类研究提供参考。
1 实验材料材料:葡萄籽样品(民权葡萄酒厂下脚料)。
试剂:DPPH ・(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基,日本东京工业株式会社生产),原花青素标准品(Sigma 公司生产,含3基金项目:河南省教育厅科技攻关项目(编号:20023600010)量98%),其它试剂均为分析纯。
主要仪器:RE -52旋转蒸发器(上海安亭电子仪器厂),LD4-2离心机(北京医用离心机厂),752型紫外光栅可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),DZF -IB 型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。
2 实验方法2.1 样品处理及有效成分分离提取取风干恒重的葡萄籽样品100g ,粉碎过20目筛,用700ml 80%乙醇浸泡过夜,水浴回流5h ,将提取液浓缩至粘稠油状,加入硅藻土拌匀,以滤纸包裹,移入索氏提取器,依次用石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等溶剂在避光下提取3h ,提取液减压浓缩后分别用乙醇定容记为A ,不溶部分用乙酸乙酯溶解后记为B 备用。
2.2 清除自由基活性试验(DPPH ・法)取0.20ml 样品溶液,加入4.00ml 的50μmol/L 的DPPH ・溶液混匀,放置30min ,以原溶剂调零点,在517nm处测吸光度记为Ai ,同法0.20mL 溶剂+DPPH ・溶液混匀测定吸光度记为Ac ;0.20ml 样品溶液+4.00ml 的溶剂混匀测吸光度记为Aj 。
按照以下公式计算自由基清除率:・41・2004年10月第5期No.5 Oct. 2004河南中医学院学报JOURNAL OF HENAN UNIVERSITYOF CHINESE MEDICINE 第19卷总第114期Vol.19Serial No.114IP (%)=[1-(Ai -Aj )/Ac ]×100其中Aj :反映样品自身对吸光度的贡献;Ac :为DPPH ・本身在测定波长的吸收;Ai :样品对DPPH ・作用后的吸光度数值。
2.3 样品用量选择与抗氧化活性测定先将乙酸乙酯组分A 部分用95%乙醇稀释为不同浓度,进行清除自由基活性试验以确定最佳样品用量,再分别用95%乙醇、乙酸乙酯稀释其它各组分A 、B 部分,取同样量进行样品活性测定。
2.4 原花青素含量测定采用香草醛-盐酸法[4],以原花青素为标准品作标准曲线,计算样品中原花青素含量。
2.5 薄层分析以甲苯∶丙酮∶醋酸=3∶3∶1体系展开,参考文献[5]进行分析。
表1 梯度提取各组活性测定结果%组分乙醇丙酮乙酸乙酯AB乙醚AB二氯甲烷AB石油醚乙醇粗提颜色暗红色棕红色红色红色红色红色黄绿色黄绿色灰绿色暗红色收率 1.0250.9610.1960.0010.2720.0040.1090.0050.326 3.050原花青素54.3358.6793.33101.0042.0040.319.070.000.0042.00IP86.4193.3393.5990.2485.9075.6135.904.884.5576.413 实验结果3.1 样品用量的选择乙酸乙酯组分A 部分用95%乙醇稀释为不同浓度,进行清除自由基活性测试结果见图1、图2。
图1 不同浓度样品的淬灭自由基活性测试图2 不同浓度样品的自由基清除率 图1的Aj -C 曲线显示:样品在测定波长517nm 下有吸收,并且随浓度的增加而增大,但当样品用量低于25μg/ml 时,Aj <0.005样品在测定波长下的吸收与测定值相比微不足道,毋须考虑样品本身对吸收度的贡献;从图2样品用量与清除率的关系看来,样品浓度0.25～10μg/ml 与清除率呈正相关关系;在样品加入浓度超过10μg/ml 时,自由基清除率在80%以上,此时若用量继续增加,清除率变化不大,且样品浓度过大,样品吸收使背景加深影响测定,在此浓度区间测定灵敏度和准确度都不高;而当C <1μg/mL 清除率小于25%测定结果的绝对误差会比较大,显然活性测定浓度范围1～10μg/ml ,清除率在25%～80%,对于比较各个组分的活性十分有利,方法灵敏度、准确度均较高。
3.2 样品测定葡萄籽样品梯度分离各组分加入浓度10μg/ml 的活性测定结果见表1。
显然:乙酸乙酯组分≥丙酮组分>乙醇组分>乙醚组分>乙醇粗提物>二氯甲烷组分>石油醚组分。
各组分活性与原花青素含量呈正相关的关系。
4 讨论由葡萄籽各级提取物的抗氧化性测定过程可以知道,判断物质的抗氧化效果,样品用量选取至关重要。
清除率与样品浓度呈正相关关系,在一定浓度范围内测定的灵敏度和准确度令人满意。
样品本身在测定波长的吸收不得不考虑,样品用量并非越大越好,其用量大到一定程度,样品活性强弱难以比较,如果用量太大,样品本身对吸收值的贡献远远超过它淬灭自由基所引起的吸光度值的减少(Aj >Ac -Ai ),样品本身的吸收会掩盖它对自由基的清除能力,由此还可能得出样品无抗氧化性或有助氧化作用的错误结论。
从梯度提取各组分的活性测定结果可见原花青素是主要抗氧化活性成分。
普遍地各组分的醇溶部分比乙酸乙酯溶解物的活性强,说明活性高的成分是水溶性好的原花青素低聚体,乙醇粗提物、石油醚组分、二氯甲烷组分、乙醚组分、乙醇组分的活性差异大,此样品用量可以明显地比较出它们清除自由基能力的差异。