荧光定量ＰＣＲ的反应模式（Ｒ：ＦＡＭ；Ｑ：ＴＡＭＲＡ）
（四）原位ＰＣＲ 是一种将ＰＣＲ技术的高度敏感、高效扩增的特 点与分子杂交方法精细定位的特点紧紧结合在一起 发展起来的分子分析技术。它在原位检测低拷贝基 因及基因低水平的表达方面有着其独特的优越性。 这一技术从建立以来就受到国外有关研究领域许多 学者的重视。研究对象从完整细胞悬液发展为细胞 涂片、细胞离心标本、冰冻切片和石蜡切片、中期染 色体标本等。研究方案亦在不断改进，总体上有以 下几种（图３）：（１）直接原位ＰＣＲ：是使用标记的引 物或游离核苷酸进行原位ＰＣＲ反应，这种标记分子 随后进入扩增产物中，扩增结果可直接观察而不需 要进行原位杂交。直接原位ＰＣＲ具有操作简便、流 程短、省时的优点，现已有不少成功的报道。但直接 原位ＰＣＲ易发生引物错配或非特异性退火，容易出 现假阳性；此外，标记的引物还会降低ＰＣＲ效率。 因而它尚需进一步改进，才能成为更加可靠的方法。 （２）间接原位ＰＣＲ：是在没有标记物的情况下进行 ＰＣＲ反应，扩增反应结束后，再用原位杂交技术来 检测扩增的信号。该方法可以克服由于ＤＮＡ修复 或引物错配引起的非特异性问题，成为目前最广泛 使用的方案。该方法需要进行扩增反应后的洗脱和 四、展望 随着分子生物学和信息学飞速发展促进了新实 验诊断技术的不断涌现，多重ＰＣＲ结合的广泛应 用Ｈ圳、原位ＰＣＲ技术的发展以及正在研究中的基 因诊断技术将会克服现有的诊断方法的缺点，发挥 越来越重要的作用。相信在不久的将来，就能用新 的基因诊断技术进行ＣＳＦ中病毒核酸的快速平等 分析、人工转入基因的检测以及基因变异、表达和定 位的研究，将更好的为Ｉ临床提供及时准确的诊断和 治疗依据。
Ａ．聚合反应
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组织样品和细胞系中的其他病毒感染如Ｐ０１ｉｏＶ、 ＭｅａｓｅｌｅｓＶ和ＨＳＶ等。利用原位ＰＣＲ对这些病毒 检测，既提高了敏感性，也达到了组织细胞定位的目 的。Ｙｉｎ等ｎ２１对哺乳动物中枢神经系统导入的外源 基因进行研究。他们以缺陷ＨＳＶ为载体，向脑内导 入功能基因，用原位ＰＣＲ都可以在脑内神经细胞中 显示１个拷贝的ＤＮＡ，而常规ＰＣＲ和原位分子杂
原位杂交过程，因而所需时间相对较长；（３）原位反 转录ＰＣＲ（ｉｎ
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ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ，ＩＳＲＴ—
ＰＣＲ）：是在原位ＰＣＲ中加上一步反转录过程 （ＲＴ），新形成的ｃＤＮＡ作为模板用于扩增。它又分 为直接ＩＳＲＴ—ＰＣＲ和间接ＩＳＲＴ—ＰＣＲ两种。该方法 可用来检测细胞或组织中低拷贝的ｍＲＮＡ或特异 基因的表达。 目前运用原位ＰＣＲ和ＩＳＲＴ—ＰＣＲ许多保存的
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阳性，４份呈现差异性结果：２份ＣＳＦ套式ＰＣＲ阳 性而ＦＱ—ＰＣＲ阴性，另外２份ＣＳＦ套式ＰＣＲ阴性 而ＦＱ。ＰＣＲ阳性，重复试验中１份ＦＱ—ＰＣＲ阳性和 １份套式ＰＣＲ阳性的ＣＳＦ检测为阴性，另２份分别 为阳性和阴性，显示出ＦＱ—ＰＣＲ技术快速省力，而 且灵敏度高，特异性强，整个程序操作不到１小时就 完成，而套式ＰＣＲ要大约５小时。
Ｄ．聚合完成
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交则不能。结果证明，原位ＰＣＲ是检测单个细胞中 低拷贝ＤＮＡ或ＲＮＡ最有效的方法。因此，可预料 原位ＰＣＲ将在检测ＣＳＦ病毒核酸等方面有着重要 的意义ｕ…。
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图２
Ｎｉｌｅ
避免误伤；对于已行抗病毒治疗的病人也需要ＣＳＦ— ＰＣＲ检测。Ｄａｖｉｅｓ报道忙１了对可疑的ＶＥｓ患者７８７ 例行ＣＳＦ常规ＰＣＲ检测，约１２％ＰＣＲ阳性，主要病 毒是ＥＢＶ、Ｅｖｓ、和ＨＳＶ。在出现症状后１４天内行 腰穿取ＣＳＦ９９例，病毒核酸检测１９例阳性，阳性率 １９％。而１５天后采集ＣＳＦ９２例，２例阳性，病毒核 酸检测阳性率２％，二者有显著性差异（图１）；也明 显高于Ｔａｎｇ等∞１报道的病毒核酸检测阳性率 ３．３％。ＭｉｔｃｈｅｌｌＨ。报道，ＨＳＶ ＤＮＡ在ＨｓＥ发病后 １天即可在ＣＳＦ中检出，平均持续１４天（１～３０ 天）。在抗病毒药物治疗后最初５天，ＣＳＦ中ＨＳ— ＶＤＮＡ可能会升高，这或许是由于有抗病毒药物存 在时，病毒复制产生许多小片段的ＤＮＡ所致。Ｔｅ— ｂａｓ等¨。在ＨＳＶ ＤＮＡ引起的单纯疱疹病毒性脑炎 （ＨＳＥ）发病后４８小时到１０天之间，ＣＳＦ ＰＣＲ检测 ＨＳＶＤＮＡ的敏感性是９６％、特异性是９９％。
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．综述． 病毒性脑炎脑脊液病毒核酸检测的研究
进展
王振海’ 谢鹏一
【摘要】
目的脑脊液病毒核酸检查是诊断病毒性脑炎的关键，而长期以来病毒学诊断技术敏
感性和特异性很差，远远不能满足ｌ临床要求。随着分子生物学的迅速发展，以ＰＣＲ技术为基础的各 种分子生物学诊断技术，成为生物医学领域内最有价值的研究手段和病毒学诊断的金标准，已经广泛 的应用于临床标本的检测，为病毒性脑炎病原学的基因诊断带来了突破性的进展；方法 本文就病毒
图ｌ
腰穿采集ＣＳＦ的时间和ＰＣＲ阳性的关系
万方数据
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！！！！！！型！！！！』！！！璺！！匹∑ｉ翌选￥！』！堡！！！！！∑！！！！！塑！：！ ９６％，而病毒培养仅为３９％，提示该法可作为诊断 ＭＶ中枢神经系统感染的金标准旧Ｊ。Ｄａｖｉｅｓ等归、１
０］
二、标本的预处理和保存 对于ＲＮＡ病毒，最好分离脑脊液有核细胞 （ＣｓＦＭＮＣ），用ＲＮＡ提取液提取细胞总ＲＮＡ，热天 提ＲＮＡ，必须带手套，因为手是ＲＮａｓｅ的主要来 源，以免ＲＮＡ降解；若ＣＳＦ呈血性，可将标本离心 沉淀含有血红素的红细胞，收集上清液抽提核酸进 行ＰＣＲ扩增，以免影响ＤＮＡ或ＲＮＡ聚合酶的活 性。但对于ＤＮＡ病毒，在含有淋巴细胞和单核细 胞的ＣＳＦ标本中，ＨＳＶＤＮＡ在２０～３０℃，２～８℃、一 １８～２０℃、一６９～７２℃中均可保存３０天，而不影响 ＰＣＲ结果№１；检测其它病毒的ＣＳＦ标本应保存于一 ２０℃或一７０℃。 三、ＰＣＲ方法 （一）逆转录聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ） 是先将ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，接着以ｃＤＮＡ为 模板进行ＰＣＲ扩增。可根据ＲＮＡ病毒（如Ｅｖｓ中 的ＰｏｌｉｏＶ、ＥＣＨｏＶ和ＣｏｘｓａｃｋｉｅＶ以及ＭｅａｓｅｌｅｓＶ、 ＭｕｍｐｓＶ等）的基因组核酸ＲＮＡ反转录再行ＰＣＲ， 以检测ＲＮＡ病毒的感染。ＥＶｓ是无菌性脑膜炎中 最常见的病原体，由于几乎所有肠道病毒都有保守 的５ ７端非编码区，在该区设计的引物可检测鉴定大 多数ＥＶｓ。Ｍｅｋｉ等用一种商业化的ＲＴ—ＰＣＲ试剂 盒检测１９９８年夏季在瑞士爆发的无菌性脑膜炎患 者共６８例ＣＳＦ中的ＥＶｓ，同时进行病毒细胞培养， 结果１６例细胞培养阳性其ＲＴ—ＰＣＲ也阳性，另外 ５２例细胞培养阴性者中２３例ＲＴ—ＰＣＲ阳性，其中 的４２例中有２６例经咽拭子或粪便培养为阳性，但 需要３～７天才能出结果，该ＲＴ—ＰＣＲ仅需５小时， 敏感性为８５％，而病毒培养敏感性仅为２４％。Ｊａｃ— ｑｕｅｓ等报道＂１ ５４例无菌性脑膜炎患者ＣＳＦ中的 ＥＶｓ，同时进行病毒细胞培养，结果２８例细胞培养 阳性其ＲＴ—ＰＣＲ也阳性，另外２６例细胞培养阴性者 ＲＴ—ＰＣＲ也为阴性。 （二）套式聚合酶链反应（Ｎｅｓｔｅｄ—ＰＣＲ） 需要设计４条共两套引物，先用外套式引物后 用内套式引物脑脊液进行两步靶基因扩增，适合于 检测脑脊液中含量低的病原体。Ｐｏｇｇｉｏ等建立了一 种ＲＴ—ｎ—ＰＣＲ，他们在核蛋白基因区设计两套引物， 检测了１０１例ＣＳＦ（分别来自无菌性脑膜炎、脑炎、 急性小脑共济失调和格林巴利综合征），最终扩增出 １１２ｂｐ的片段，１８例细胞培养阳性的ＣＳＦ经该法检 测全为阳性，另外２８例细胞培养为阴性的ＭＶ感 染者中２６例ＲＴ—ｎ—ＰＣＲ为阳性，其诊断符合率为
Ｖｉｒｕｓ）等。由
于不同的病毒感染，病变范围、程度相差悬殊，临床 表现十分复杂，给诊断带来困难，确诊的主要依据是 脑脊液的病原学诊断，但脑脊液中病毒含量甚低，其 病毒培养检测不但费时、费力，而且敏感性和特异性 很差，远远不能满足临床要求，严重滞后于临床治 疗，造成该类疾病的死亡率居高不下或病后严重的 后遗症。本文就目前ＶＥ的脑脊液（Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ，ＣＳＦ）病毒核酸检测的研究进展综述如下： 一、标本的采集时间 ＶＥ患者ＣＳＦ标本采集，原则上是在出现神经 系统局灶症状或体征时行腰穿检查，穿刺时应尽量
建立了一套ＲＴ—ｎ—ＰＣＲ，他们在ＨＣＭＶｇＢ基因区设 计两套引物，１１１１—１１３０（５
ＣＡＣＴＴＴＣＴＴＡＴＧ３ ７）
ＣＧＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＡＴ（＞３
７一
ＡＴＧＡＣＣＧＣ—
、１０７４—１０９６（５ ７一ＡＴＧＡＣ—
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１３４１一１３５９
（５
７一
ＴＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣ一３ ７）、１０５７＋１０８２（５
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基金项目：２００４年宁夏高等学校科学技术研究资助项目（Ｎｏ： ０６２）；２００４年宁夏卫生厅基金重点资助项目（ｗ２００４０２１） 作者单位：＊宁夏医学院附属医院综合病房（宁夏银川市 ７５０００４）；＊＊重庆医科大学附属第一医院神经内科（重庆市
４０００１６）
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７一
ＡＣＣＡＴＴＣＧＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＣＡ一３ ７），检
测了２６例ＣＳＦ样本，有３例ｇＢｌ型阳性、１０例ｇＢ２ 型阳性和８例ｇＢ３型阳性，阳性率分别为１１．５％、
３８．５％和３０．８％。
（三）荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ—ＰＣＲ） 在常规ＰＣＲ基础上，在反应体系中加入一种带 有２个荧光标记的探针，该探针可与引物包含序列 内的ＤＮＡ模板发生特异性杂交，标记在５’端者为 荧光报告基团（Ｒ），荧光发射峰值在５１８ｎｍ处，３’端 者为荧光淬灭基团（Ｑ），荧光发射峰值在５８２ｎｍ处， 两者可构成能量传递结构，即当探针保持完整时，Ｑ 抑制或吸收Ｒ发出的荧光。探针自身的３’端羟基 己被去除或封闭（３’末端被磷酸化），不具有延伸的 能力，探针在无特异性ＰＣＲ发生时，荧光信号无变 化。当发生特异性ＰＣＲ时，复性期探针与模板 ＤＮＡ发生杂交，延伸期Ｔａｑ酶随引物延伸沿ＤＮＡ 模板移动，当移动到探针结合的位置时，发挥其５’ 一３’外切酶活性，将探针切断，Ｑ的抑制作用被解 除，Ｒ的荧光信号被释放出来（５１８ｎｍ处的光密度增 加而被荧光探测系统检测到）。模板每复制一次，就 有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放（图 ２）。释放的荧光基团数目和ＰＣＲ产物量是一对一 的关系，因此可对模板进行准确定量。当荧光信号 增强到某一阈值即循环阈值（Ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，Ｃｔ） 时，此时的循环次数即被记录下来。该参数与ＰＣＲ 体系中ＤＮＡ起始量的对数值之间有严格的线性关 系。利用阳性梯度标准品的Ｃｔ值制成标准曲线，再 根据样品的Ｃｔ值即可准确定出起始ＤＮＡ的量。 Ｋａｚｕｅ等。１“根据Ｍｖ ｓＡ９５６／Ｊａ００病毒株的Ｆ基因 序列设计了一套引物Ｆ１０７３（５ ７一ＴＣＴＣＡＣＣＣＡＴＡＧ—