第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属［30］，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6〜0.8 X.0〜3.0 ym。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长［31］。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类［32］。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1a表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱PYX-250S-A长沙科技双目生物显微镜BME (BA/E3 ) 科力仪器分析天平BS224S德国来卡手提式不锈钢蒸汽灭菌锅DSX-280B北京化丰超净工作台SW-CJ-1FD上海南鹏精密数子式酸度计PHS-3C上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇（95%）、CaC03、（NH4）2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4 7H2O、FeCb、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2 培养基[33-37]表2.2.1. b培养基成分表Tab 2.2.1. b Medium composition名称踰糖酵母膏无水乙醇（v/v）琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保臧培养基1%1%1%pH自然改进后的斜面液体⑸保臧培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5Horyer-Frateur 培养⑺基3%pH自然⑻GYC 培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼冋糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%产5-酮基葡萄糖酸(11) 土卜拉K甘^培口养基3%1%2%2%pH自然(12)i\7亦公* -H-"1%1%2%乙酸钙1% pH 氧化乙酸培养基7.2乳酸钙2%(13) 氧化乳酸培养基1%1%2%pH7.0-7.2乙醇培养基1%3%2%pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30 C培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有（NH4）2SO40.1% , K2HPO40.1% , KH2PO40. 01% , 0.025% , FeCb0. 0005% ;以上培养基均以121C 灭菌20 min。
2.2.3醋酸菌的分离纯化2.2.3.1分离纯化实验称取醋醅样品5g,液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8, 涂布在分离培养基上，培养2d 后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。
连续在平板上培养3 次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4C的冰箱。
2.2.3.2 革兰氏染色实验将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24 h,制作水晶镜片进行革兰氏染色。
2.2.3.3 产醋酸定性实验[38]取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3% (v/v) 的无水乙醇，32C 震荡培养60 h,取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液(2.5 mol/L) 调节pH至7.0,加入5~6滴5% FeC3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。
根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39] 为醋酸菌。
2.2.3.4 醋酸定量实验经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32C、140 r/min恒温震荡培养60 h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。
醋酸定量测定[40]：精确吸取发酵液2 mL至250 mL三角瓶中，并加入蒸馏水50 mL，滴加1~2 滴0.5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定至微粉色。
产酸量(g/L) = (V-V 0) >C NaOH >60/样品毫升数；式中：V=发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；V0=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数；C NaOH=NaOH 溶液的浓度(mol/L)；60 为醋酸分子量。
2.2.3.5 耐酒精能力实验初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从5%到14%，每个梯度相差1%，32E恒温培养3d，观察其是否生长，筛选出耐酒精性能好的菌株。
2.2.3.6 传代稳定性实验[41]将上述所筛选出的菌株，每隔一个月，转接纯化后的菌株，连续转接培养7 代，并测定其酸度，来判断、筛选，传代最稳定和产醋酸最高的菌株。
2.2.3.7 不同保藏方法保藏醋酸菌的存活期限实验[43]将传代相对稳定性的菌株，分别按照培养基 2.2.2中的⑶、⑷、⑸转接，待斜面上菌苔丰厚，保藏于2C〜4C的冰箱内，每隔三个月再次转接，并观察其存活情况。
2.2.4 菌种鉴定实验[44-45]2.2.4.1 培养实验观察通过平板培养，观察菌落形态特征，并挑取单个菌落制做水晶片，革兰氏染色，同时在1000 倍光学显微镜下观察其细胞形态、大小和排列特征。
2.2.4.2 培养特征实验⑴观察所选菌株在平板上培养的情况；⑵观察所选菌株是否能在高糖培养基上生长；⑶观察所选菌株是否能在Hoyer-Frateur 培养基上生长。
2.2.4.3 生理生化实验[46]⑴接触酶的试验：在长势旺盛的平板上，滴加3%的H2O2，观察有无气泡产生。
⑵以铵盐为唯一氮源的生长试验：观察在培养基2.2.2中⑺中生长情况。
⑶GYC培养基产色素试验：观察在培养基2.2.2中⑻上能否生成棕色的水溶性色素。
⑷生酮试验(甘油生成二羟丙酮的试验)：在培养基2.2.2中⑽上，将费林液注满平板，观察菌落周围是否有红色沉淀出现。
⑸产5- 酮基葡萄糖酸盐试验：在培养基2.2.2中(11)上，32T培养24 h后,观察菌落周围是否有白色不透圈。
⑹葡萄糖产酸试验：观察培养基指示剂是否变色。
⑺产纤维素试验：在含糖培养基上向菌落上滴加Lugol 碘液和60%硫酸液，观察菌落周围变化情况。
⑻氧化乙酸的能力试验：在培养基222中(12)上，32C培养48 h，观察菌落周围是否出现乳白色的晕圈。
⑼氧化乳酸的力试验：在培养基2.2.2中(13)上，32T培养48 h,观察菌落周是否出现乳白色的晕圈。
⑽在以乙醇为唯一碳源的培养基上，观察其能否生长。
2.2.5 发酵条件实验⑴发酵温度单因素实验以培养温度为梯度，26C、28C、30C、32C、34C、36C，将筛选所得的菌种，分别接种于装有100mL 醋酸菌发酵培养基的500mL 三角瓶中，置于180r/min的恒温摇床培养72h，以产酸量和醋酸菌数来确定最佳生长条件。
⑵将筛选所得的菌种，分别接种于分离平板上，观察出现透明圈的时间，确定最快产酸时间。
2.3 结果与分析2.3.1 分离筛选⑴分离纯化：从分离平板中挑选出107个单菌落菌株。
⑵初步筛选：通过醋酸菌分离培养基筛选，选出44个单菌落产酸菌株。
⑶复筛：又经革兰氏染色和醋酸定性试验，淘汰了革兰阳性及不产醋酸的菌株，选出4 株醋酸菌株。
⑷产酸定量试验，筛选出产酸量大最快的菌株，结果见下图 2.3.2 .A图2.3.1.A 4株醋酸菌产酸量测定Fig 2.3.1.A Four stra ins in determ in ati on of acid acetic acid bacteria⑸耐酒精能力试验，筛选出耐酒精性能好菌株，结果见下图2.3.2.B图2.3.1.B 4株醋酸菌耐酒精测定Fig 2.3.1.B 4 of acetic acid bacteria resista nt to alcohol determ in ati on⑹然后继续对2株性能较好菌株进行传代培养，确定其传代的稳定性。
每代产酸量见下表2.3.1a表2.3.1.a 4珠醋酸菌传代培养每代产醋酸的测定(g/L)Tab 2.3.1.a 4 strains acetic acid bacteria in each generation nestin)cultivati ng the determ in ati on of acetate(g/L)2代39.431.531.543.43代38.330.430.142.34代37.427.326.340.65代35.127.922.738.76代30.624.119.536.97代28.421.814.735.5由表2.3.1.a可以看出，每代发酵培养中，菌株X4的醋酸产量最高，并在传代培养过程中产量稳定，故选该菌株为目的菌株。
⑺存活期限试验：把X4菌株接入三种斜面保藏培养基，每隔三个月接种到各方法所用的培养基上。
观察其存活情况，见表 2.3.1.b:表2.3.1.b三种方法保藏醋酸菌的存活时间Tab 2.3.1.b Three methods of acetic acid bacteria survival time of biomaterial注：“ ”表示生长；“ ”表示生长良好；”-”表示不生长。
从2.3.1.b看可以出，普通斜面保减法保藏的保藏时间小于3个月；而液体保藏法的保藏时间大于18个月；但改进后的斜面液体保藏法，能在20个月内都保持生长良好，且保藏的时间可达24个月。
醋酸菌所产的酸，是造成醋酸菌保藏时间受到限制的原因之一。
随着保藏时间的延长，尽管醋酸菌能抵抗一定的酸，但一直处在酸性环境中，醋酸菌会被自己产的酸所杀灭。
因此，在菌种生长的很健壮后又加入碳酸钙和液体培养基，既降低了氧气的含量，又中和了产生的醋酸，使其在生长和保护方面较液体保藏更加先进了一步，保藏效果也更好。
2.3.2分析鉴定结果2.3.2.1菌株X4形态特征显微镜下细胞呈椭圆或短杆状，无芽抱，单个或成对、成链排列2.322 X4培养特征X4在基础平板培养基上生长旺盛，形成灰白色圆形菌落，表面光滑、凸起，边缘整齐，培养48h能产酸，使CaCO3溶解形成明显的透明圈。
继续培养能氧化乙酸产生CO2和H20,菌落周围出现乳白色透明圈。
在斜面培养基上生长良好，培养2 d产酸。