提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展肖生科1,2　王磊2　陈毓荃1(1西北农林科技大学生命科学学院,杨凌　712100;2中国农业科学院生物技术研究所,北京　100081)摘　要:　巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。

外源基因在该系统中表达时,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低,甚至不表达的情况。

对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析,结合具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。

关键词:　巴斯德毕赤酵母　酵母表达系统　基因表达The Study on Improving Expression Levels of H eterologousG ene in Pichia pastorisXiao Shengke1,2　Wang Lei2　Chen Yuquan1(1College of L if e Sciences,Northwest Sci2Tech U niversity of A gricult ure and Forest ry,Yangli ng　712100;2Biotechnology Research Instit ute,Chi nese Academy of A gricult ural Sciences,Beiji ng　100081)Abstract:　As a eukaryote expression system,Pichia pastoris has been widely used in genetic engineering,which has many merits in the gene expression,protein process and secretion.The gene expression is influenced by a number of factors,such as the structure of gene,secretion signal peptides,methanol concentration,induction phase,temperature, PH,and promoter etc.These factors make some heterologous genes express unstably or express a little.This article ana2 lyzes these factors and reviews how to im prove expression levels of heterologous genes in Pichia pastoris.K ey words:　Pichia pastoris　Y east expression system　G ene expression 动物、植物、微生物作为生物反应器为外源基因的表达提供了理想的环境,是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容,也是生命科学研究领域的热点之一[1]。

大肠杆菌被誉为是外源蛋白质表达的“工厂”,其具有易操作性,生长速度快,培养条件简单等优势。

但是,大肠杆菌是低等的原核生物,不具有真核生物中mRNA翻译后修饰、加工的场所———内质网和高尔基体。

虽然许多真核生物基因在大肠杆菌中可以表达,但有些表达的产物缺乏天然的生物活性或结构。

哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白,但操作复杂,表达水平低,产业化生产造价昂贵,不易普遍推广使用[2]。

酵母是单细胞低等真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性,同时又具有真核生物基因产物正确折叠所需的细胞内环境和糖链加工系统,还能分泌外源蛋白到培养液中,利于纯化[3]。

1　利用巴斯德毕赤酵母表达外源基因的优缺点酿酒酵母(S.cerevisiae)是首先被用来作为外源基因表达的宿主菌,然而其表达重组蛋白有一定的局限性,使其产业化应用受到了限制[1]。

出芽酵母(Kl uyverom yces lactis)表达外源基因时与酿酒酵母相似,但表达量偏低,也不利于推广应用和规模化生产。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是甲基营养型酵母,其乙醇氧化酶启动子(AOX)已被分离、克隆,这种酵母已经发展成为外源蛋白表达非常成功的宿主[4]。

人们已在巴斯德毕赤酵母中已成功表达了多种外源蛋白,如IGF21和人血清蛋白已通过临生物技术通报・综述与专论・ B IO TECHNOL O G Y　BULL ETIN 2004年第2期床试验;乙肝表面抗原在南非已作为小单元疫苗投放市场[4];人重组白细胞介素11(rhL211)[5]、人血管内皮生长因子受体Flt2l胞外区223loop[6]、血管生成抑制因子(K4K5)[7]、抗Ⅳ型胶原酶单链抗体[8]等医药用蛋白均成功表达。

与其他表达系统相比,巴斯德毕赤酵母有以下诸多方面的优点:①在蛋白质诱导表达的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源,但不存在象细菌、动物细胞培养中的内毒残留问题[9]。

②在缺少葡萄糖的情况下,巴斯德毕赤酵母以甲醇作为唯一的碳源生长[10]。

表达实际上是利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子,从而启动乙醇氧化酶的表达,在有乙醇氧化酶存在的条件下进一步催化甲醇的代谢,进行重组蛋白质的表达。

③具有真核生物翻译后的糖基化修饰、折叠、加工和外分泌的环境,使生产的蛋白具有天然的高级结构及生物学活性。

④有两个基因编码乙醇氧化酶基因———A O X1、A O X2。

其中A O X1基因的表达主要受较高水平的甲醇诱导和调节。

巴斯德毕赤酵母既保持了酿酒酵母的优点,还能大幅度提高外源蛋白的产量[9]。

⑤许多在大肠杆菌中不能表达的蛋白质在巴斯德毕赤酵母中得到了有效的表达,其方便的操作和低廉的成本使毕赤酵母表达系统极具市场潜力。

⑥表达分泌的蛋白质常被O2糖基化或N2糖基化,其中主要是在蛋白质氨基酸序列的Asn2X2SerΠThr位点处进行N2糖基化,以高甘露糖型的糖基化形式存在,寡糖链的长度一般为8～14个甘露糖残基[9]。

与酿酒酵母相比较,巴斯德毕赤酵母在表达蛋白质过程中是适度的糖基化修饰,使所表达的外源蛋白结构与构象更接近于天然蛋白。

此外,如果是糖蛋白,还经高尔基复合体对糖链的进一步剪切,使表达蛋白的糖链不含α123甘露糖,避免了酿酒酵母中的免疫原性问题,使表达的糖蛋白更适于治疗用途[10]。

尽管巴斯德毕赤酵母在表达外源蛋白有以上优势,但是外源基因在表达过程中受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,使外源蛋白的表达随环境条件的变化而不稳定,甚至一些蛋白的表达量会很低或不表达。

因此,通过对这些可能影响外源基因表达的各种因素进行系统的分析,得出提高外源蛋白表达量的可能途径就具有重要的理论和实践意义。

2　提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达量的途径2.1　优化基因内部结构外源基因在巴斯德毕赤酵母中能否表达或表达量高低首先受到外源基因的内部结构的影响,也是表达成败的首要因素。

可以通过以下几种途径优化基因内部结构以实现外源蛋白的表达。

①优化mRNA5′端非翻译区(5′U TR)的核苷酸序列和长度,mRNA的非翻译区对蛋白表达的影响主要表现在mRNA的翻译水平上。

A O X1mRNA的5′U TR 长114nt,富含A+U。

目的蛋白mRNA应尽可能具有与A O X1mRNA相近,最好是相同的5′U TR。

一般地,目的基因编码序列的第一个A TG应尽可能接近,最好处于A O X1A TG的位置[11]。

Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白mRNA与AOX1mRNA的5′U TR相同后表达水平提高50倍以上[12]。

同时,一个适当长度的5′U TR可极大地促进mRNA有效地翻译。

②起始密码子旁侧序列改造:如果起始密码子周围容易形成RNA二级结构序列,将会阻止翻译的进行,通过RNA折叠分析可找到可能阻碍翻译正常起始的二级结构,然后利用替代密码子重新设计并调整翻译起始区及其旁侧序列,对基因进行改造[13]。

③A2T序列改造:目的基因的特性对表达的影响被认为是一种种属特异性的现象[14]。

有些基因内部富含A2T序列,可在转录的过程中提前终止而导致仅产生低水平或截短的mRNA[11],给基因的表达带来困难,因此在不改变翻译蛋白质密码子的条件下去掉A2T序列,除去mRNA中可能形成终止结构的区域,使目标蛋白得到表达。

④基因人工合成:在不改变氨基酸组成的前提下,将编码外源蛋白的密码子优化为酵母的偏爱密码子,可以实现外源蛋白在酵母体内表达或表达量的显著提高。

在酵母中表达量较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子[15]。

在巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶时,把在酵母中使用频率为0的精氨酸的密码子突变为使用频率较高的密码子时,表达水平提高了37倍[16]。

⑤氨基酸序列改造:蛋白质氨基酸序列中如果含有高度复杂的胱氨酸结42 生物技术通报Biotechnology　Bulletin 2004年第2期构基序,这种结构可能是影响合成效率的因素之一,因此可改变这部分的碱基,消除复杂的胱氨酸结构基序[17]。

2.2　分泌信号的改造外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达分为胞外和胞内两种表达情况,表达的蛋白要分泌到胞外必须经过信号序列的引导[17]。

信号肽与目标蛋白相融合,从而在蛋白质加工折叠后引导其分泌到胞外。

最常用的信号肽是来源于酿酒酵母的A因子信号肽和巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽,其中以A 因子信号肽最为成功,也是使用最广泛的信号肽,它能促进多种异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达[4]。

但有时在表达一些蛋白的过程中,A因子信号肽用就不能引导外源蛋白分泌或不能有效地分泌到胞外,而使胞外目标蛋白的浓度极低,给后面的分析和检测带来不便。

因此,改造信号序列,引导目标蛋白高效的胞外分泌也可提高目的蛋白的表达量。

信号肽对不同的异源蛋白分泌效率会有很大的差异,有些外源蛋白甚至不能被A因子和酸性磷酸酶信号肽分泌,需要新的信号肽才能使外源蛋白分泌[18]。

有些信号肽的分泌效率还受胞内mRNA的积累水平、培养条件和诱导条件的影响[19]。

在A因子中间插入EEAEAEAEP K共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高2倍以上[10]。