0. 32 m ol/L, dNTPs 0. 25 mm ol/L, M gC l2 2 mm ol/L, rTaq DNA 聚合酶 1 U。 PCR反应程序: 98 5 m in; 80 2 m in ( 进行 到 1 m in 57 s时暂停, 加入 rTaq DNA 聚合酶 ); 94 1 m in, 36 1 m in, 72 1 m in, 45个循环; 72 延伸 5 m in。扩增产 物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测, 然后使用 SYNGENE 凝胶成 像系统观察结果。 1. 3 数据处理 选取扩增产物条带清晰、重复性好的进行 记录, 每个样品的扩增带数有带赋值为 1, 无带为 0。采集的 数据输入 Excel 2003, 建立表征数据矩阵。每两个样本之间 的遗传相似系数用 N ei等 [ 11] 的公式计算: F = 2NXY / (NX + N Y ), 其中, F 是任意两个样本之间的相似性系数, NX、NY 分 别是样本 X、Y扩增出的 DNA 片段总数, NXY是样本 X 和 Y共 有的 DNA 片段数。用 MVSP 3. 1软件计算相似性系数, 获得 相似性系数矩阵, 采用非加权平均距离法 ( UPGMA ) 进行聚 类分析, 构建树系图。 2 结果与分析 2. 1 7种菊科植物样品 DNA RAPD 多态性分析结果 在 RAPD分析中, 从 50条随机引物中筛选出 10条扩增清晰、重 复性好、多态性高的引物。引物 S2008扩增的 7种菊科植物
摘要 [目的 ]利用 RAPD 技术研究 7种菊科药用植物的遗传多样性及亲缘关系。 [方法 ]从 50条 10 bp随机引物中筛选出 10个多态性 好的引物进行 RAPD扩增, 扩增 DNA 片段数据用 UPGMA 聚类法构建系统发育树。 [结果 ] 10条引物共扩增出 337条带, 多态性带 337 条。聚类结果显示, RAPD 分子标记构建的系统发育树在族内属间与传统分类系统一致。 [结论 ]该研究可为菊科药用植物的鉴别提供 参考, 并为针对性地进行菊科植物的保护提供依据。 关键词 菊科; 药用植物; RAPD分析 中图分类号 R 284. 1 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2010) 17- 08964- 03
38卷 17期
樊晓霞等 7种菊科药用植物的 RAPD分析
8965
的 RAPD图谱见图 1。 10条引物对 7种菊科植物 DNA 进行 扩增, 共产生 337条不同分子量的谱带, 各个引物产生的多 态性条带数不一 (表 1)。每条引物在 7 种菊科植物中都产
生了不同的指纹图谱, 且没有 1条引物能在所选菊科植物中 扩增出共有条带, 这说明所选菊科植物的遗传相似性较低, 遗传物质的差别较大。
RAPD Analysis of Seven Species of M ed icalP lants from A steraceae FAN X iao xia et al ( College of L ife Sciences and Engineer ing, Southwest Jiaotong U niversity, Chendu, S ichuan 610031) A bstract [Ob jective] The research ami ed to analyze 7 spec ies of m edical plants from A steraceae by random am plified po lym orph ic DNA ( RAPD ) analysis. [M ethod] 7 species o fm edica lplants from A steraceae were am plified by 10 selected prmi ers from 50 prmi ers, and the results were generated by UPGMA a lgorithm to cluster genetic distance cacula ted from RAPD data. [ Result] 10 selected pr mi ers were able to produce 337 clear po lym orphic bands which were all po lym orphic. The genetic results based on RAPD m arkerswere consistantw ith that of the traditional classification to som e exten.t [ Conc lusion] The study can prov ide reference for identifing m edical plants from A steraceae, and lay basis for its corresponding protec.t K ey w ords A steraceae; M edical plants; RAPD analysis
2010 03 17
rTaq DNA 聚合酶购自大连宝生物工程有限公司; NaC 、l Tris、 EDTA、SDS、醋酸钾、醋酸钠、巯基乙醇均为进口分装试剂; 其 他试剂为国产分析纯。 DNA 提取缓冲液 [ 500 mm ol/L N aC l、 100 mm ol/L T ris HC l ( pH 值 8. 0) 、50 mm ol/L EDTA ( pH 值 8. 0)、2% 巯基乙醇 ] ; [9] TE 缓 冲液 [ 10 mm ol/L TrisH C l ( pH 值 8. 0)、1 mm ol/L EDTA ( pH 值 8. 0) ]。 1. 2 方法 1. 2. 1 DNA的提取。采用改良 SDS法 [ 10] 提取 DNA, 用核酸 蛋白定量仪检测 DNA 溶液的浓度和纯度, 并将其稀释为 10 m g /m ,l 于 - 20 冰箱储存备用。 1. 2. 2 PCR 扩增。 PCR反应在 PTC 100TM B IO RAD PCR仪 上进行, 反应体系总体积为 25 ,l 包括模板 0. 6 ng / ,l 引物
引物
Prim er S88 S111 S288 S296 S339 S1222 S1361 S1422 S2008 S2158 总计 Total
序列 ( 5 3 ) S equ ence
TCA CGT CCA C CT TCCGCAGT AGG CAGAGCA GGGCCAA TGT GTGCGA GCAA GT CCTCGT GT TCGGA TCCGT GT CGTCGTCT CCACAGCCGA GA CG CTTGT C
F ig. 1 RAPD amp lified by prim er S2008
2. 2 7种菊科植物聚类分析结果 由表 2可知, 在由 337
个 RAPD标记获得的 Nei氏相似性系数矩阵中, 7种菊科植
物两两间相似系数分布在 0. 043~ 0. 303, 平均相似性系数
为 0. 173。其中 天名 精与 苍耳 之间 的相 似系 数最小, 为 0. 043, 表明这 2个物种亲缘关系最远。采用 UPGMA 法进 行聚类分析, 构建树系图见图 2。由图 2可知, 依相似性系 数 0. 289水平, 同为向日葵族 ( Trib. H elen ieae Cass. )的 2份 材料 (鬼针草和苍耳 )聚为 1支, 其余 5份材料各为 1 支, 因 此可以将 7份材料以族为单位进行分类, 这与传统分类结 果 [ 12] 一 致。并 且 在传 统分 类学 上, 青蒿 属于 春 黄菊 族 ( T rib. An them ideae) , 天名 精属 于 旋覆 花族 ( Trib. Inu leae C ass), 马兰属于紫苑族 ( T rib. A stereae C ass. ) , 它们同向日 葵族共属于向日葵超族 ( Supertrib. H elianthanae Y. R. L in) ; 斑鸠菊 为斑 鸠 菊超 族 ( Supertrib. V ernon ianae) 斑鸠 菊 族 ( T rib. An them ideae); 白术为帚木菊超族 ( Supertrib. M u tis ia nae)菜蓟族 ( Trib. C ynareae)。而依相似性系数 0. 147水平 时, 可以观察到同为向日葵超族的 5份材料分裂为 2 支, 马 兰、天名精和青蒿聚为 1支, 与斑鸠菊超族的斑鸠菊遗传相 似性更接近; 而鬼针草与苍耳聚为 1支, 与帚木菊超族的白 术遗传相似性更接近。
多态性条带数比率 % Polym orph ic fragm en ts rate
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
注: M 为 250 bp DNA LadderM arker; 1代表青蒿; 2代表鬼针草; 3代 表马兰; 4代表天名精; 5代表斑鸠菊; 6代表白术; 7代表苍耳。
菊科 ( A steraceae)是世界上种子植物中最大的科, 分布 在我国的有 240属, 2 300多种。近年来, 有诸多学者从细胞 学、同工酶及 DNA分子水平上对部分菊科植物进行了较为 系统的研究。他们发现, 药用菊品种比观赏菊品种更接近菊 属野生种 [ 1]。栽培菊主要起源于 D endran the indicum、D. vesti tum 和 D. nankingense[ 2- 3] 。在菊属野生种、栽培菊及种间杂 种间父母本亲缘关系近的遗传距离较小, 杂交亲和性好, 结 实率较高; 反之, 杂交亲和性差, 难以结实 [ 4]。新疆红花具有 丰富的遗传多样性, 可划分为 4 个主要类群, 且与其生态地 域性不存在相关性 [ 5] 。冷蒿居群表现出丰富的 RAPD 多态 性, 居群亲缘关系与其地理分布有着密切关系 [ 6] 。大多数来 源相同的观赏向日葵种质资源表现出较为密切的亲缘关 系[ 2] 。引物 S40扩增的指纹图谱特异性最强, 能同时将 30 份野生菊和 2份栽培种菊明确区分开来, 可作为种质鉴定的 重要依据 [ 8]。在上述研究的基础上, 笔者对峨眉山的几种药 用菊科植物进行 RAPD分析, 旨在为菊科药用植物的鉴别提 供参考, 也为针对性地进行菊科植物的保护提供依据。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 研究对象。青蒿 ( Artem isia apiacea H ance)、鬼针草 ( B iden s pilosa L. )、马兰 [K a lim eris indica ( L. ) Sch. B ip. ]、 天名精 (C arpesium abrotanoides L. ) 、斑鸠菊 [ Vernonia cinerea ( L. ) Less. ]、白 术 ( A tractylod is m acrocephala K oidz)、苍 耳 (X an th ium sibiricum Patrin. ), 来源于四川峨眉。 1. 1. 2 主要试剂。RAPD PCR 扩增引物购自上海生工生物 工程技术服务有限公司; dNTPs、250 bp DNA LadderM arker、