第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理
原理 1
包被
反应加入待测抗
体或抗原和酶标
2
抗原或抗体
3 洗涤使结合在
固相上的抗原 抗体复合物与 未结合的分离
底物显色
4 定性或定量 的分析
二、ELISA方法建立的基本步骤
（一）ELISA方法类型的建立 1 初步确定方法类型 2.工作条件的优化 3.ELISA检测结果测定 （二）对建立的方法进行评价
二、包被抗原或抗体
包被
coating 将抗原或抗体结合于固相载体
（直接包被、间接包被）
封闭 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～
block 20%小牛血清消除固相载体表面未 ing 结合的位点，消除非特异性吸附
直接包被
稀释抗原或抗体（用0.05mol/LPH9.6的碳酸
盐缓冲液稀释抗原或抗体到3-10µg/mL）
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
4、加酶标抗体
与特异性抗原结
合，加底物显色
+
捕获法原理
EE E
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
4、加酶标抗体 无抗原结合，
- 加底物不显色
第三节 习 题
1 下列哪一种ELISA最常用于抗原的测定（ ）
小结
酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标 记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法， 在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底 物的作用进一步提高敏感性。
均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的 测定，异相酶免疫测定根据是否使用固相支持物， 又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。
标记酶的要求：
E ELISA间接法
5 关于ELISA竞争法，下列叙述正确的是（ ）
A 用于检测抗原
B 被测物与酶标记物的免疫活性各不相同
C 被测物多则标记物被结合的机会少
D 待测管的颜色比对照管的浅则表示被测物量少
E 结合于固相的酶标记抗原量与被测抗原量成正比
第四节 酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)
包被有待测细胞因子抗体的微孔板
基
+
分泌相应细胞因子的待测细胞
本
有或无刺激物培养
原 细胞因子被板上的特异性抗体捕获
理
后续的反应如同ELISA
一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜
色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关
酶联免疫斑点试验(ELISPOT)
第五节 发光酶免疫试验（LEIA）
原理：参与催化某一发光反应的酶来标记抗 体（或抗原），在抗原-抗体反应后加入发光 物，酶催化和分解底物发光，由光检测仪检 测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测 物的含量。
EE E
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
3、加酶作用
EE E
E
的底物不显色
3、加酶作用
或显色弱
的底物显色
+
竞争法测抗原 -
ELISA检测抗体的方法
间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的
抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常测定HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等
间接法测抗体 -
E EE
+
E EE E EE
ELISA检测抗体的方法
双抗原夹心法 ➢原理：类似双抗体夹心法 ➢操作步骤：类似 ➢应用：乙型肝炎表面抗体
ELISA检测抗体的方法 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：HBcAb和HBeAb的检测
竞争法
非经典竞争法
非经典竞争法
ELISA检测抗体的方法 捕获法 应用：
酶和酶作用底物
常用底物
ALP 底物
对-硝基苯 磷酸酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物 为黄色对硝基酚， 最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基 酶作用后，生成 β-D半-乳糖 高强度荧光物 ， 苷（ 4MUG ） 用荧光计 测量。
第二节 酶免疫试验的分类
酶
酶免疫组化 组织切片或其它标 本中抗原的定位
一、固 相 载 体
➢固相抗体或抗原就是把抗体或抗原 结合到固相载体的表面
➢固相抗体或抗原是非均相酶免疫 技术中将游离和结合的酶标记物 迅速分离的最常用方法
固相载体
要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性
•利于反应充分进行
种类
•固相方法简便易行，快速经济 •微孔板 •磁微粒 •膜载体
A 双抗体夹心法ELISA B 间接法ELISA
C 竞争法ELISA D 捕获法ELISA E 补体结合法
2 捕获法主要用于何种物质的测定（ ）
A IgG B IgA C IgM
D IgD
E IgE
3 下列关于双抗体夹心法原理，不正确的是（ ）
A 使用分别针对抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作 为酶标记物
原理及特点
原理： ➢酶标抗体（抗原）与抗原（抗体） 的特异性反应 ➢酶对底物的显色反应 ➢对抗原或抗体进行定位、定性或 定量的测定分析
原理及特点
特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。
第一节 酶免疫试验的组成要素
均相酶免疫测定 最具代表性的两种技术：
酶放大免疫分析技术EMIT enzyme-mutiplied
immunoassay technique
克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫分析技术EMIT示意图
常用酶：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和溶菌酶
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基）
与275nm（主酶） OD ELISA中应用最为广
值之比
泛的标记用酶
酶和酶作用底物
常用酶 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP
病原体急性感染诊断中的IgM型抗 体
甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
原理：
捕获法
抗人IgMμ链抗体包被
捕获待测标本中IgM类 抗体
加入特异性抗原和酶 标记特异性抗原的抗 体
底物显色
EE
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
B 一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗 体
C 可使标本和酶标抗体同时加入成为一步法
D 用于检测二价或二价以上的抗原
E 采用高亲和力的单克隆抗体可提高检测的灵敏度和 特异性
4 下列何种方法用一种标记物可检测多种被测物（ ）
A ELISA双抗体夹心法 B ELISA竞争法
C 放射免疫法 D ELISA捕获法
邻苯二胺 (OPD)
HRP的常见底物 5-氨基水杨酸 (5-ASA )
2,2′-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS)
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
胺 (OPD)
(5-ASA )
2,2′-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS)
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
免
疫
均相：不需要分离
试
验 酶免疫测定技术
液体标本中抗原或
固相酶免疫试验 异相
抗体的定性和定量
液相酶免疫试验
一、均相酶免疫试验
用于小分子激素和半抗原（如药
原
物）的测定
理 酶标记物与相应的抗原或抗体结
合后，标记酶的活性会发生改变，
不用分离结合和游离酶标记物，通
过测定标记酶的活性的改变，而确
定抗原或抗体的含量。
+
双抗体夹心法测抗原 -
ELISA检测抗原的方法
竞争法 方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清 和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被 物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半 抗原（药物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
三、方法类型及反应原理 三个必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清 ，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗 原 测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、 HCG等
E EE
EEEE NhomakorabeaEA 多用于大分子物质的测定
B 酶标抗原和抗体在固相载体表面形成复合物，作用 于底物显色
C 需要分离结合和游离酶标记物
D 常利用酶标记抗原与抗体结合后的空间位阻降低酶 活性