3´
3´ A(A)nA
5´
5´ 3´ 末端转移酶 + dATP 5´ 3´A(A)nA 3´ T(T)nT 5´
5´
T(T)nT 3´
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
四、外源DNA导入宿主细胞——转
受体菌条件： 安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
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一、目
（三）PCR扩增特定基因
（四）人工合成
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从基因组DNA文 库获取目的基因
组织或细胞染色体DNA
限带的所 有基因组DNA的集合
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青海大学医学硕士研究生课程
医用分子生物学 实验技术
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重组DNA技术操作步骤
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基本原理
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体细胞
外源基因与载体的连接 重组体的筛选
五、目的基因的筛选和鉴定——筛
外源基因导入宿主细胞后，筛选含有 目的基因的阳性克隆并加以扩增。
所用的方法主要有遗传学方法、免疫
学方法、核酸杂交法、PCR等。
1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选 (2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选 (3) 利用标志补救筛选 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选 2. 序列特异性筛选
1.克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是
DNA水平上的操作。
2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
实验原理
• 普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产 物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A； • T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有 一个单链状态的T；
克隆基因的表达
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主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞
④ DNA重组体的筛选和鉴定
⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究
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以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
克隆载体 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌
限制酶切位点
cos L R cos
真核生物染 色体DNA
限制酶消化
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌
目的基因片段与 T载体 DNA连接，达到克隆基因
的目的。
• 材料：目的基因片段（回收的PCR产物） • 药品：pEMG T-Vector (Promega公司)
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数千碱基对。常
有1 ~ 3个抗药
性基因，以利于 筛选。
质粒载体
基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。 这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主 细胞。宿主和载体编码的片段各自半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转 化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位 点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有
目的片段（100ng/ul） pGEM-T Easy（50ng/ul） T4 DNA Ligase 2×Rapid Ligation Buffer Total • 备注：混合均匀，瞬时离心。 4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。 3μl 1μl 1μl 5μl 10 μL
说 明
1. 回收 DNA 片段可以用沉淀法，但是只适用于 PCR 扩增 产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行；
（一）黏性末端 （二）人工接头的使用
（三）加入同聚体尾 （四）平端连接
（一）黏性末端
（二）人工接头
（三）加入同聚体尾
待克隆DNA片段
混合、退火
重组质粒
空白质粒
（四）平端连接
目的基因
5´ 3´ 5´ 限制酶或机械剪切 3´ 5´ λ-核酸外切酶 3´ 5´ 3´ 5´
载体DNA
限制酶 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dTTP 3´
(1) RE酶切法
(4) DNA测序法
(2) PCR法
(3) 核酸杂交法
（一） 遗传学方法
1. 插入灭活法
插入失活筛选带有重组载体的克隆
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2. 蓝-白筛选（α互补）
许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含
有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨
活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。
α互补筛选（蓝-白筛选）
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PCR产物的T载体 克隆和转化
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实验目的： 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。 实验要求：
掌握利用 T 载体克隆 PCR 产物的方法；复习连接
实验流程。
技术应用：
2.此种连接方法是根据普通 Taq酶会在3´末端加一个A的
原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的
Taq酶会自动切除末端的 A，所以，这种酶的扩增产物
需要补加A后再连接。 3.T- 载体的阳性克隆筛选同样可以使用录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
复制
双链cDNA 载体
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
重组DNA分子受体菌 cDNASI核酸酶化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。
二、载体的选择与准备——选
几种常用克隆载体的比较
比较内容 质 粒 λ噬菌体 黏性质粒 M13噬
+
<22 kb
+ +
40～50 kb
+ -
<1 kb
-
亚克隆
序列分析 E.coli表达
+
+ +
+ +
-
+
+ -
注：+表示可用；-表示不可用
三、DNA分子的体外连接——接
• 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，
从而达到克隆的目的。
载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位
pGEM-T 载体的结构
pGEM-T Easy 载体的结构
实验步骤
（1）目的片段的制备--胶回收法回收PCR产物：
(2)连接实验：
在0.2ml PCR管加入以下试剂：