1 材料与方法
1. 1 标本来源 收集 2008-03—2008-12 间，广东省人民医 院 36 例疑似膀胱尿路上皮性肿瘤患者的晨尿标本，其中男 性 29 例，平均年龄 65. 62 ± 10. 37 岁； 女性 7 例，平均年龄 66. 86 ± 10. 75 岁。 1. 2 方法 1. 2. 1 标本处理 每例患者连续 3 天留取清晨新鲜中段尿 液200 ml，1 h 内送检； 尿液经1 200 r / min 离 心10 min 后 去 上 清，加 3 ml 胶 原 酶 B，吹 打 悬 浮 细 胞 后 置 37℃ 水 浴 箱 中 20 min，1 200 r / min离心10 min，去上清，加3 ml 0. 075 M KCl 低渗溶液（ 使用前在37℃ 水浴中预热30 min） ，重新吹打悬浮 细胞，置37℃ 水浴箱中孵育20 min；缓慢加2 ml 固定液（ 甲醇 ∶ 冰 醋 酸 3∶ 1 ） 于 试 管 中，混 匀、预 固 定，1 200 r / min 离 心 10 min去上清；轻轻吹打悬浮细胞，室温下缓慢加入5 ml 固 定液10 min；重复固定 2 次，1 200 r / min离心10 min去上清，至 原体积的 1% 体积（ 管内约几百个细胞） ，用移液器吹散；紧 靠玻片滴片，56℃ 环境中老化玻片30 min。 1. 2. 2 玻片预处理 将滴好的玻片室温下于 2 × SSC（ pH 7. 0） 溶液中漂洗 3 × 2 min；室温下0. 1 M HCl 溶液中浸泡 70 min；室温下 2 × SSC（ pH 7. 0） 溶液中漂洗 3 × 2 min；将玻 片置于37℃ 胃蛋白酶溶液中消化7 min。 1. 2. 3 荧光原位杂交 FISH（ 北京金菩嘉医疗科技有限公 司） 的 两 组 探 针，分 别 为 CSP3 / CSP7 （ 红 色 / 绿 色） 、CSP17 / GLP p16（ 绿色 / 红色） 。室温下将7 μl 探针缓冲液、1 μl去离 子水、2 μl探针加入微量离心管离心2 s；旋涡混匀后再次短 暂离心，将液体滴加到玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，橡皮 胶封边，将 玻 片 置 于 杂 交 仪 中 （ 73℃ 变 性5 min，42℃ 杂 交
Relationship between FISH test of hematuria exfoliated cells and tumor myometrial invasion in patients with suspected bladder cancer
XU Jie1，2 ， ZHANG Fen2 ， ZHANG Minɡ-hui2 ， LI Li2 ， ZHUANG Henɡ-ɡuo2 ， LIU Yɑn-hui2 ， ZHAO Tonɡ1 （1. Department of Pathology，Nanfang Hospital，Guɑnɡzhou 510515，China； 2. Department of Pathology，Guɑnɡdonɡ General Hospital / Guangdong Academy of Medical Sciences，Guɑnɡzhou 510010，China） Corresponding author： ZHAO Tonɡ （ E-mail：zhaotongketizu@ 126. com） ； LIU Yɑn-hui （ E-mail： yanh-liu@ yahoo. com） Abstract： Objective To study the specificity and sensitivity of FISH in detecting chromosome aberration of exfoliated cells in urine，and to evaluate its relationship with pathologic stage of bladder tumor. Methods Two groups of DNA probe were applied in FISH. CSP3 and CSP7 were fit for hybridization of kinetochore domain of chromosomes 3 and 7， respectively，while GLPp16 and CSP17 were fit for hybridization of the long arm of a chromosome 9（9q21） and kinetochore domain of chromosome 17，respectively. Hematuria from 36 cases of putative bladder tumor were submitted to FISH detection，routine cytologic examination and pathological diagnosis were carried out parallelly. Statistic analysis was applied to explore the relationship between the detection results of Fish，cytology and pathologic stage. Results The FISH sensitivity was 73. 33% ， while specificity was 88. 46% ， which showed a higher sensitivity than that of cytologic examination （26. 70% ） . The sensitivity of FISH was higher in muscle-invasive cases （88. 24% ） than that in non-muscleinvasive cases （53. 85% ） ，and both were higher than that in cytologic examination （ 15. 38% ，35. 29% ） . All of these difference had significantly statistical value （ P < 0. 05） . The aberration ratio in chromosomes 3，7，9，17 was 88. 34% ， 64. 71% ，70. 59% and 88. 24% ，respectively. The abberant of chromosomes 3 and 17 related to the tumor invasion，and the degree of the aberration positively related to the deepth of tumor invasion （ rp = 0. 591，P < 0. 05； rp = 0. 523，P < 0. 05） . Conclusions FISH has higher sensitivity and specificity for the detection of bladder tumors than that of cytologic examination，especially for those with muscle invasion. In addition，chromosomes 3 and 17 abnormalities are correlated to the deepth of invasion. Key words： Fluorescence in situ hybridization； Bladder tumor； Chromosome aberration
16 h） 过夜。 1. 2. 4 玻片洗涤 于暗处移除盖玻片后，将玻片置于盛有 2 × SSC 溶液（46 ± 1℃ 水浴） 瓶中，晃动玻片 1 ～ 3 s，10 min后 取出；再置于盛有 2 × SSC /0. 1% NP-40 溶液（46 ± 1℃ 水浴） 瓶中，晃动 1 ～ 3 s，5 min后取出；室温浸泡在 70% 乙醇中， 3 min后取出；暗处自然干燥，将15 μl DAPI 复染剂滴加于杂 交区域，立即盖上盖玻片；于4℃ 冰箱放置20 min后，在荧光 显微镜下观察玻片。 1. 2. 5 正常阈值建立 采集 20 例正常人尿液标本，按照 FISH 检测方法，每组探针观察 100 个细胞，统计出不同类型异常细胞 数的百分比。阈值 = 平均值（M） + 3 × 标准差（SD）。 1. 3 结果判定 计数 100 个细胞，分别使用 2 组探针进行 检测。CSP3 / CSP7 分别杂交于 3 号和 7 号染色体的着丝粒 区域，CSP3 荧光信号为绿色（ FITC） ，CSP7 荧光信号为橘红 色（ Rhodamin） ；GLPp16 杂交于 9 号染色体长臂 （9q21） ，荧 光信号为橘红色；CSP17 杂交于 17 号染色体的着丝粒区域， 荧光信号为绿色。间期细胞单个细胞核中，橘红色信号与绿 色信号各显示 2 个为正常细胞，出现无信号为完全缺失，单 信号为部分缺失，> 3 个为扩增（ 图 1） 。选择杂交信号均匀 的区域和信号清晰可辩的细胞进行信号计数。检测值大于 阈值（ M + 3SD） 判定为阳性结果，小于阈值判定为阴性结 果，等于阈值须增加观测样本细胞的数量。如 p16 FISH 检 测结果中只有一个信号点的间期细 胞 比 例 > 3. 9% （ 阈 值 6% ） ，则判断该例是 p16 基因缺失的阳性病例；如 p16 FISH 检测结果中只有一个信号点的间期细胞比例 < 3. 9% （ 阈值 3% ） ，则判断该例是没有 p16 缺失的阴性病例。 1. 4 病理组织学 取患者活检或术后组织标本行常规病理 检查，由两名以上专业的病理医师共同阅片。 1. 5 统计学分析 采用 SPSS13. 0 统计分析软件，应用 χ2 检验和 Spearman 相关分析对结果进行统计学分析。