研取和mRNA分离；
第二，第一链 cDNA 合成；
第三，第二链 cDNA 合成；
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第四，双链cDNA克隆 进质粒或噬菌体载体，
并导入宿主中增殖。
5'
mRNA5' DNA3'
5' 3'
5' 3'
5' CC机械力量切割成 一定长度的DNA片段，与合适载体体 外转化至宿主细胞补DNA。cDNA是 由生物的某一特定器官或特定发育时 期细胞内的mRNA经体外关系
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基因组学的载体和方法也各有不同。构建的宏基
文 因组学分为载体克隆和基于新一代测序技术的 库 加接头的建 体(bacterial artificial chromosome,BAC）和粘粒
宏基因组学 研究的对象是特 定环境下所有生 物遗传物质的总 和，它包含了可 培养的和不可培 养的微生物的基 因总和。研究热 点：细菌和病毒 宏基因组学。
病毒宏基因组学
病毒宏基因组学：宏基因组学的一分支，指研究特定环境中的病 毒群落一门学科。
分析特定环 境中的病毒
群落
应用
解释未 知病因
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2
学习高级生物 化学、分子生 物学、PCR技 术和DNAstar 软件。
3
阅读与病 毒宏基因 组相关的
文献
谢谢大家！ 请大家批评指正！ 2020/6/16
遗传物质的 分离与富集
2020/6组DNA或cDNA片段 与适当的载体在体外通 过重组后，转化至宿主 细胞，并通过一定的选 择机制筛选后得到大量 的阳性菌落(或噬菌体), 所有西圣 保罗阿道夫•鲁茨 研究所的西尔瓦娜 等人利用病毒宏基 因组学对人面部潜 在微生物进行研究。
Electron micrographs of the human fecal sample. (a) Rod-shaped particles negatively stained with potassium phosphotungstate in 2003. (b) Icosahedral (open arrows)and short rod-shaped particles (filled arrow) recently stain2e02d0/w6/1it6h ammonium molybdate, from the second fraction of the sucrose gradient.
高通量测序
罗氏公司454焦磷酸测序技 术和Illumina公司推出的 Solexa测序技术
受限于表达 型的宿主菌 株、工作量 大及效率低。
荧光原 位杂交 技术法
序列拼接--拼接的contigs或者单序 列通过不同的数据库进行核苷酸和 氨基酸的比对--筛选有用的目的信息。
研究成果与前景展望
对患有肠道病毒性肠炎的火鸡群，进行病毒宏基因组学分析，发现了大量的呼肠孤病毒、 小ＲＮＡ病毒、星状病毒等，系统描述了多种病毒共同感染火鸡，导致火鸡生产性能降低 的可能性（Day，2010）。 对采集北美的蝙蝠粪便进行病毒组学研究，结果发现蝙蝠体内携带的病毒种类十分丰富， 不仅含有大量的动物病毒，而且还有植物和昆虫病毒（Li，Donaldson，2010）。 在美国猪群中发现了kubovirus,sapovirus,sapelvirus,猪肠道病毒9和猪肠道病毒10，星 状病毒，Teschovirus，PBoV3,环病毒，新的微小核酸RNA病毒等。其中星状病毒和 PBoV3为新的种；环病毒、Rosavirus1 和Rosavirus1 可能为的新的病毒属或者新的病毒 科（单同领，2011）。 在我国腹泻儿童粪便中首次发现HBoV2、HPeV、Aichi virus、Klassevirus/salivirus和 Human cosavirus 等新发病毒（单同领，2011）。
（coamid）载体]、表达载体(pBluescript SK+)、穿梭载
体(Cosmid pOS700Ⅰ)及普通克隆T载体。
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研② 高纯度大分子量基因组 DNA的提取。 ③ 高质量大相对分子质量 DNA 的部分酶切与脉冲电 泳分级分离。 ④ 载体与外源片段的连接 与转化或侵染宿主细胞。 ⑤ 重202组0/6/1克6 隆的挑取和保存。
连接
转化
筛选阳 性克隆
研究策略与技术路线
连接
目的基因
载体
载体的种类 质粒（plasmid） λ噬菌体（λ phage） 粘粒载体（cosmid） 细菌人工染色体BAC 酵母人工染色体YAC
可装载的外源DNA ＜10kb
0-23kb ~45kb
~100kb ~300kb-1.2Mb
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病毒宏基因组学何以横空出世
很多病毒缺乏特异的 细胞系或者生长过程 中观察不到细胞病变
用电镜来观察病毒 其灵敏性相对较低。
(CPE)。
四大
瓶颈 PCR法必须基于基因
血清学反应，高效的特异
序列，对于未知序列的病
性抗体很难获得，有的出
毒和变异性大的病毒此法
现交叉反应而影响结果。
难以实施。
宏基因组学
宏基宏因基组因学组(学M(eMtaegtaegneonmoimcsi)c是s) 将环是境将中环全境部中微全生部物微的生遗物传的信遗传 息看信作息一看个作整一体个,整自体上, 而自下上地而研下 究微地生研物究与微自生然物环与境自或然生环物境体或生 之间物的体关之系间。的关系。
发掘潜在 的新的病 毒性疾病
挖掘新 的活性 物质
病毒宏基因组学
最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的科学家是Breitbart教 授，他于2002年应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次对 美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜 在的新病毒。
2005年,Edwards首次提到病毒宏基因组学这一概念，其描述的 是环境中的病毒群落—噬菌体。
2006年，Zhang等应用宏基因组学在人的粪便中发现了大量的 植物病毒。
2007 年, Delwart 再次提到病毒宏基因组学这一概念,并对宏基 因组学挖掘新病毒的方法进行了阐述； 该文侧重于人和动物机体 中的真核病毒群落。
2010 年，Li 等分析了蝙蝠粪便中的病毒群落。该研究发现了大 量新的哺乳动物病毒和昆虫病毒。
研究策略与技术路线
样品的处理 遗传物质的分离与富集 构建 宏基因组学的筛选序列分析
2020/6/16
研究策略与技术路线
VIS:Very Important Step
稀释
解冻
样品的处理
消化
过滤
离心
2020/6/16
研究策略与技术路线
反转录 双链 cDNA 合
成
DNA RNA
PCR 扩增
PCR 产பைடு நூலகம் 的纯化
Oligo(dt)纤维素柱或磁珠分离
Oligo(dt)+reverse transcriptase
RNase H
DNA ploymerase DAN ligase
TdT加尾
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AAAA
AAAA TTTT
第一步： mRNA的分离。
第二步：第一 条cDNA链的合 成。
AAAA TTTT
AAAA3' TTTT5'
读书报告
汇报人：李小阳
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2103年1月4日
病毒宏基因组学概述及其应用
研究背景 宏基因组学简介 病毒宏基因组学 研究策略与技术路线 研究成果与前景展望
Here We Go！
一大难题
virus B
virus C
virus A virus D
BACTERIA
在人类生产生活中，致病的微生物众多，其中病毒性疾病占据大多
描绘出一些中间宿主的病毒携带情况，这不仅丰富 了病毒库，而且增加了对病毒多样性和分布的了解。
实时监测一些致病性病毒和潜在致病性病毒的变化 情况，并且有助于诊断一些新发的或尚不明病原体的疾 病，还可以快速地侦检突发病毒性公共卫生事件。
过滤技术 高通量测序法
病毒宏基因 组学数据库
面临的挑战
学习计划
1
继续进行副 猪嗜血杆菌 TbpA基因的 原核表达与 蛋白纯化
应用病毒宏基因组学技术结合高通量测序和生物信息学分析我国腹泻仔猪粪便内的病毒群 落，初步鉴定出此次腹泻的主要病因为变异PEDV；分离和鉴定1 株变异PEDV（JS2013），其可作为研发疫苗的候选毒株（单同领，童光志，2013）。
2020/6/16
前景展望
前景展望
运用病毒宏基因组学，已经成功地从多种环境样品 中鉴定出多种病毒，使人们了解到不同环境的病毒构成 ，从而更科学地防制病毒的侵染。
第三步：第 二条cDNA 链的合成。
AAAACCCC 5'
第四步： 克隆双链 cDNA至 载体并导 入E.coli
筛 选法
稳定性 同位素 技术筛 选法2020/6/16
能有效 的筛选 到具有 活性的 物质和 新型抗 生素。
底物诱 导基因 表达法
数，而现有的诊断方法不可能囊括所有的病毒。因此，从宏观上把
握致病性病毒的潜在数量种类以及致病机理变得尤为重要。
2020/6/16
两个案例
案例1： 2002年Breitbart应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次 对美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114 个潜在的新病毒。遗憾的是无法对其进行归类。
虽然载体种类众多，但基于研究的目的 基因大小以及相关文献的报道，质粒载 体和BAC的选用较为频繁。
转化
研究策略与技术路线
宿主
宿主选择----常用的宿主主要有大肠 埃希菌以及链霉菌属或假单胞菌属。