网络出版时间：2014-02-17 09:02网络出版地址：/kcms/detail/64.1008.R.20140217.0902.004.html人肝癌细胞株中FOXM1 及NF-κB的表达及意义王琦1，柴磊2，蒋少青3，马丽4 ，金栋5 ，殷利军5，张桂香5，谢岩青5 （1.宁夏医科大学总医院肝胆外科，银川 750004；2.宁夏回族自治区第三人民外科，银川750004；3.宁夏医科大学总医院药剂科，银川 750004；4.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院药剂科，银川 750004；5.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院血管外/普外科，银川750004）1[摘要] 目的探讨不同肝癌细胞株中转录因子FOXM1（Forkhead Box M1）及核转录因子NF-κB（nuclear factor kappa B）的表达强度及意义。
方法采用Western blot、RT-PCR法，检测不同肝癌细胞株（QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721）中FOXM1及NF-κ B 在蛋白及mRNA 水平的表达情况。
结果在3株肝癌细胞中FOXM1及NF-κB的表达无论是mRNA水平还是蛋白水平均存在显著差异，细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1及NF-κB的表达同时都明显高表达于细胞株SMMC-7721。
结论肝癌细胞株中FOXM1蛋白及mRNA表达与NF-κB表达趋势一致，提示FOXM的表达可能与NF-κB的活化有关。
[关键词] FOXM1；NF-κB；肝细胞肝癌[中图分类号]R735.7 [文献标识码]AExpression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells WANG Qi1，CHAI Lei2，JIANG Shao-qing 3，MA Li4，JIN Dong5，YIN Li-jun5 ,ZHANG Gui-xiang5，XIE Yan-qing5，（1. Dept.of Hepatobiliarysurgery，theAffiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；2. Dept.of Surgical， the Third People′s Hospital of Ningxia. Yinchuan 750004；3. Dept.of Pharmacy，theAffiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；4. Dept.of Pharmacy，the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；5.Dept.of Vascular/General Surgery， the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ.Yinchuan 750004）ABSTRACT Objective（1）To investigate the expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells. Methods The expression of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B protein and micro-RNA in hepatocellular carcinoma cell lines(QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721)were detected with the application of Western blot analysis and RT-PCR analysis，respectively. Results The expression基金项目：宁夏自然科学基金（项目编号：NZ1236）作者简介：王琦(1983-),硕士，主任医师，肝癌复发相关分子机制的研究。
通作者：谢岩青，Email：xie-yanqing@levels of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B varied significantly among three cell lines.Western blotting and RT-PCR showed that hepatocellular carcinoma (QGY-7703、BEL-7402) cells expressed higher FOXM1 and NF-κ B levels than SMMC-7721（p<0.01）. Conclusion FOXM1 protein and mRNA expression in human liver cancer cells and the NF-κ B expression trend is consistent，Prompt FOXM1 expression is associated with the activation of the NF-κ B.Keywords Forkhead Box M1; nuclear factor kappa B; HCC(hepatocellular carcinoma);近来研究发现,转录因子FOXM1在人肝细胞癌组织中表达高于癌旁组织，并且发现FOXM1表达与肿瘤增殖、微血管形成和凋亡抑制相关[1]。
课题组前期研究中应用肝细胞癌及癌旁组织样本建立的组织芯片进行免疫组化检测，综合分析后发现,FOXM1高表达与肝癌恶性病理表型和患者预后不良关系密切[2]。
IKK/IκB/NF-κB是人类肝炎后肝细胞癌中常被激活的经典通路[3]，当NF-κB被释放、活化后，进入细胞核转录激活肿瘤增殖、转移、生长、血管形成、凋亡抑制等相关基因促进癌症恶性进展[4,5]。
因此,本研究通过Western blot和RT-PCR技术分析FOXM1及NF-κB在肝癌细胞株中的表达情况，为进一步探讨FOXM1是否通过NF-κB的激活促进肝癌恶性进展的分子调控机制提供理论依据，希望有助于阐明FOXM1促进肝癌恶性进展的具体机制。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 细胞：人肝癌细胞株QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721购于中国科学院典型培养物宝藏委员会细胞库。
1.1.2 主要试剂：兔抗人FOXM1抗体、鼠抗人NF-κB抗体、GAPDH多克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司，HRP-山羊抗兔、鼠IgG购于BioGenex公司，细胞RPMI1640培养基购于Gibco公司，Western相关试剂购于碧云天生物技术研究所，RNeasy Mini 试剂盒购于QIAGEN公司，RT－PCR 试剂盒购于TOYOBO公司，PCR引物购于上海生工，ECM发光试剂盒购于武汉博士德公司，胎牛血清购于Gibco公司。
1.2 实验方法1.2.1 细胞培养：QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721细胞应用RPMI1640培养基，细胞株接种于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素/链霉素）和RPMI1640培养液的培养瓶中，置37℃、5%恒温孵育箱中培养；传代应用0.25%的胰蛋白酶消化。
具体实验采用细胞为对数生长期的CO2细胞。
1.2.2 FOXM1及NF-κB的蛋白表达水平：应用对数生长期的细胞QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721检测各株细胞中FOXM1蛋白及NF-κB核蛋白表达情况，具体实验方法参考本课题组前期发表文章[6]（其中NF-κB核蛋白提取方法具体步骤参考碧云天试剂盒提供方法），FOXM1、NF-κB和内参对照GAPDH的蛋白分子量大小分别为100KD、65KD和37KD；实验中各种抗体稀释比例为：FOXM1抗体（按1︰400稀释）、NF-κB抗体（按1︰200稀释）、GAPDH 抗体（按1︰2000稀释）和二抗（按1︰5000稀释）。
1.2.3 FOXM1及NF-κB的mRNA表达水平：细胞总RNA的提取应用对数生长期的细胞（QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721），具体实验方法参考本课题组前期发表文章[6]。
目的基因及内参对照扩增引物序列为：FOXM1上游（F）5，―GGGCGCACGGCGGAAGATGAA―3，,下游（R）5，―CCACTCTTCCAAGGGAGGGCTC ―3，，产物大小为379bp；NF-κB上游（F）5，-CGCATCCAGACCAACAACA-3，,下游（R）5，―TGCCCAGAAGGAAACACCA―3，，产物大小为269bp；GAPDH 上游（F）5，―GAAGGTGAAGGTCGGAGTC―3，，下游（R）5，―GAAGATGGTGATGGGATTTC―3，，产物大小为226bp。
具体反应条件如下：FOXM1（95℃预变性2min，95℃变性40s，55℃退40s，73℃延伸1 min，循环40次，73℃延伸5min）；NF-κB（94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退30s，72℃延伸1 min，循环35次，72℃延伸5min）；GAPDH（95℃预变性2min，95℃变性40s，55℃退火40s，73℃延伸1min，循环35次，73℃延伸5min）。
1.3 统计学方法：应用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料用x±s表示，比较采用t检验进行统计学分析，以P<0.05视为差异有统计学意义。
2 结果2.1 Western blot 法检测不同人肝癌细胞株中FOXM1蛋白及NF-κB核蛋白表达:各株人肝癌细胞中的FOXM1蛋白及NF-κB核蛋白表达水平见图1及图2。
结果显示细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1及NF-κB的表达都明显高于细胞株SMMC-7721，表达有统计学意义（P<0.01），FOXM1相对光密度值QGY-7703:（0.770±0.053）、BEL-7402:（0.810±0.073）、SMMC-7721:（0.132±0.021）；NF-κB相对光密度值QGY-7703:（0.680±0.056）、BEL-7402:（0.872±0.071）、SMMC-7721:（0.141±0.015）。