2016/3/4
28
固定相-C18柱
型号：ZORBAX Eclipse XDB-C18 填料：SiO2
2016/3/4
29
流动相
乙晴 0.2%醋酸 问题： 乙晴是极性还是非极性？ 醋酸的作用？
2016/3/4
30
分析物质
主要物质： BPA 其它物质： Phenol ISTD BPE IPP o,p- BPA CD-2 Triphenol Chroman
2016/3/4
31
T-550.M
2016/3/4
32
作用原理
疏水性
弱
强
2016/3/4
33
疏水性强弱
如果样品有： - CH2…CH2CH3 ： 碳链 ：芳香基 疏水性强
如果样品有： - COOH： 羧基 - OH：羟基 - NH2：氨基
2016/3/4
疏水性弱
34
HPLC重要组成
2016/3/4
48
定量分析-归一化法
举例说明： 色谱图中总共出现3个峰，分别记为A、 B及 C，积分测 得其对应面积为SA、SB及SC。 由此可计算： 100% wA SA S A S B SC
100% wB SB SA SB SC 100% wC SC SA SB SC
高效液相色谱使用粒径更细的固 定相填充色谱柱，提高色谱柱的 塔板数，以高压驱动流动相，使 得经典液相色谱需要数日乃至数 月完成的分离工作得以在几个小 时甚至几十分钟内完成。
《液相色谱现代实践》
2016/3/4 8
Cap.2 色谱法的原理及分类
2016/3/4
9
什么是色谱法
色谱法（ Eng ： Chromatography ，又称层析）是一种分 离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领 域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相 态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗 脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动， 最终达到分离的效果。
2016/3/4
13
Cap.3 相关名词解释
2016/3/4
14
色谱图（一）
信号(mV)
进样 空气峰 基线
半峰宽 峰 高 h
死时间 校正保留时间 保留时间
2016/3/4
时间(min)
15
色谱图（二）
基线
分辨 率
色谱图 拖尾
噪音
色谱 峰
漂移
2016/3/4 16
问题分析
积分线
未分离 噪音 漂移
35
Cap.5 GC-7890A
2016/3/4
36
问题一：GC是什么？
A1. Gas Chromatography 气相色谱
2016/3/4
37
问题二：GC的原理？
A2. GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异 来实现混合物的分离。
样品 进样气化 色谱柱分离 检测器
2016/3/4
载气
2016/3/4 41
1-C250.M
180˚C
80˚C
40˚C
2016/3/4
42
GC重要组成
检测 气路 进样
温控
分离
2016/3/4 43
进样器
2016/3/4
44
FID vs. TCD
FID与TCD比较 FI 价格 噪音
2016/3/4
H2-Air可燃有机 物
2016/3/4
HPLC 0.4cm 15-50cm 4μm-10μm 50-200atm 10-30min
26
1-5cm 50-100cm 150μm-200μm 1-10atm 0.5h-day
问题二：HPLC的特征？
高压
高效
应用广
高速
高灵敏 度
2016/3/4 27
液-固色谱法（反相）
流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝 等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。 流动相的极性大于固定液的极性。
S1
2016/3/4
S2
Sx
S3
S
50
定量分析-内标法
举例说明： 测得内标品含量为w0，内标品峰面积为S0；待测样品峰 面积为Sx，峰总面积为S，求待测样品含量wx。
w0 f0 S0 wx fx Sx f x/0 fx f0
51
2016/3/4
问题？感谢！
2016/3/4 52
无机物及水 高 较高 低
气态热导系数不 同物质
几乎无局限 低 便宜 较低
45
Cap.6 分析方法
2016/3/4
46
定性分析
1. 2. 3. 4. 色谱定性分析能力较IR/MS/NMR差。 利用保留时间定性。 利用相对保留时间定性。 利用已知物增加峰高法定性。
2016/3/4
47
定量分析-概念
色谱技术和理论的发展： 色谱技术标准化、自动化 检测器的开发 塔板理论和Van Deemter方程 保留时间、峰宽、分辨率等概念
2016/3/4
7
高效液相色谱问世
20 世 纪 60 年 代 末 ， 科 克 兰 （ Joseph Jack Kirkland ）等人开 发世界上第一台高效液相色谱仪， 开启了高效液相色谱的时代。
三级学科---色谱学 关键词---流动相、固定相、吸附、洗脱、分离。
2016/3/4
10
色谱法分离原理
凝胶过滤层析 也叫做分子排阻层析 SEC ， 一 种 利 用 带 孔 凝 胶珠作基质，按照分子 大小分离蛋白质或其它 分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来， 小分子后流出来。
亲和色谱法 利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异 性亲和力，进行选择性 分离。主要用来从细胞 提取物中分离纯化核酸、 蛋白等。 Step 1：建立平衡 Step 2：进样、洗涤 Step 3：洗脱
2016/3/4
氯仿 Chloroform
5
诺贝尔化学奖（1952）
Archer John Porter Martin
2016/3/4
Richard Laurence Millington Synge
6
气相色谱出现
1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分 离的想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用 氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸。
11
2016/3/4
色谱法分类（按色谱介质分）
a. 柱色谱法（Column chromatography） b. 纸色谱法（Paper chromatography） c. 薄层层析（Thin layer chromatography）
2016/3/4
12
色谱法分类（按流动相物理状态分）
a. 气相色谱（GC） b. 高效液相色谱（ HPLC） c. 亲和色谱（Affinity chromatography）
2016/3/4
17
峰面积计算
2016/3/4
18
分辨率计算
R
trb tra 1 Wb Wa 2
2016/3/4
19
分辨率区别
R<1
R>1.5
2016/3/4
20
固定相 Stationary Phase
2016/3/4
21
流动相 Stationary Phase
2016/3/4
色谱分析的重要作用就是对样品定量，依据组分的 含量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。 定量公式可表示为：wi = fi Si， 其中wi为待测组分i的含量， Si为组分i的峰面积， fi为比例系数（定量校正因子）。 如果要确定 wi，只需准确测出峰面积Si与比例系数 fi 。
2016/3/4
信号记录
38
固定相-毛細管柱
型号：DB-WAX 125-7032 填料：SiO2
2016/3/4
39
流动相-载气
氩气 He 氮气 N2
2016/3/4
40
分析物质
前座FID： 甲醇 1-C250.M 苯酚 1-PHENOL.M 丙酮 1-ACETONE.M
后座TCD： 甲醇-水 2-V255.M ETBZ 2-C220V225.M
22
固定相/流动相如何作用
2016/3/4
23
Cap.4 HPLC-1260
2016/3/4
24
问题一：HPLC是什么？
A1. High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱
2016/3/4
25
问题二：HPLC的特征？
A2. 经典LC与HPLC比较 经典LC 管柱内径 管柱长度 填料粒径 操作压力 分离时间
2016/3/4 49
定量分析-外标法（校正曲线法）
举例说明： 精 确 配 制 A 物 质 标 准 溶 液 浓 度 100ppm 、 300ppm 及 500ppm，进样后测得各峰的面积为 S1、S2及S3。再次测 含A待测样品峰面积为Sx，其中wx求法如下：
w/ppm 500
wx
300 100
wx = f Sx +b
脱镁叶绿素
叶绿素A 叶绿素B 叶黄素
新叶黄素
薄层层析
2016/3/4
4
色谱分析法普及
1938 年 阿切尔 · 约翰 · 波特 · 马丁 和 理查德 · 劳伦斯 · 米林 顿· 辛格 分离不同种类的氨基酸，他们将氨基酸水溶液 吸附在固相的硅胶上，以氯仿冲洗，成功地分离了氨基 酸。
硅胶 Silica gel
色谱法原理及应用