凝胶固定相孔径间的渗透系数的差 别 按流动相的性质不同：
流动相为有机溶剂——凝胶渗透色谱
流动相为水溶液——凝胶过滤色谱
主要用于分离生物大分子组分
五、亲合色谱法（AC） 分离机制：利用组分与固定相表面
上配基的专属性亲和作用的差别 固定相——具有生物活性的配基键
合到载体表面上形成 适用于生物样品中酶、抗体、受体
按流动相与固定相极性的相对强弱 分类： 正相色谱法、反相色谱法
一、※液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附 剂
分离机制：利用溶质分子占据固定 相表面吸附活性中心能力的差异
调节溶剂极性，可以控制组分的保 留时间
出柱顺序：强极性组分后出柱，弱 极性组分先出柱
二、※液液分配色谱法（LLC）
分离机制：利用组分在两相中溶解度 的差异
※正相色谱—固定相极性 > 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后 柱，适用于分离溶于有机溶剂的极性及 中等极性的分子型物质，用于含有不同 官能团物质的分离。
※反相色谱——固定相极性 < 流动 相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组 分后出柱 用于分离非极性至中等极性的分子 型化合物。
※（二）高压输液泵及梯度洗脱装置 一、高压输液泵的种类 高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量
的流动相。 （1）注射式泵（又称螺杆注射泵）
（2）往复型泵 （又称往复柱塞泵）
二、高压输液泵的原理 往复柱塞泵，柱塞向前运动，液 体输出，流向色谱柱；向后运动， 将贮液瓶中液体吸入缸体。如此 往复运动，保证将流动相以稳定 的速度流过色谱柱的部件。
占有机物的20%
HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包 括有机介质溶液），不受样品挥发性 和热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
2．流动相的区别
GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作 用力，只与固定相有相互作用。
（4）超声波脱气法
（5）在线真空脱气法
流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响 液相色谱分离的一个非常重要的实 验因素。改变流动相的性质和组成 将改变溶质组分的保留值、分离选 择性和柱效。在实际工作中，流动 相的可选择范围较大是液相色谱的 一个显著特点。
※液相色谱中, 组分的保留值 大小决定于组分与流动相和固 定相分子间作用力：比如吸附 、分配、离子交Байду номын сангаас、亲和力等 。
HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作 用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对
分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余 地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到 调控作用，当选用不同比例的两种或两种以 上液体作为流动相也可以增大分离选择性。
3．操作条件区别 GC：加温操作（※对气相色谱分离效
通常对于亲水固定液采用 疏水性 流 动相
三、离子交换色谱法（IEC） ※分离机制：利用组分与固定相表
面离子的交换能力的差别（与流动 相的性质无关）
离子交换色谱与紫外－可见检测器 适用于检测可离解化合物
离子交换色谱与电导检测器结合适 用于检测无机离子——离子色谱法
四、空间排斥色谱法（SEC） 分离机制：利用组分的分子尺寸与
液
值的缓冲 液，可加
溶液
入改性剂
分离原理
吸附与解 吸
溶解与挥 发
可逆性的 离子交换
多孔凝胶 的渗透或 过滤
具有锁匙 结构络合 物的可逆 性离解
（四）高效液相色谱法的定性定量分析方法
与气相色谱法的分析方法基本相同 定性分析方法：
色谱鉴定法 化学鉴定法 两谱联用鉴定法 定量分析方法： 外标法 内标法 面积归一化法（要求每一个组分 都出峰）
等的分离
六、化学键合相色谱法（BPC）
分离机制：利用化学反应将固定液 的官能团键合在载体表面，使组分 在吸附－分配的过程中分离
应用较广泛的色谱法：反相键合相 色谱
固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱）
流动相：极性大的甲醇-水或乙腈水 流动相极性 > 固定相极性
按分离过程物理化学原理分类的各种液相 色谱法的比较
吸附色谱 分配色谱 离子色谱 空间排阻 亲和色谱 色谱
固定相
全多孔固 固定液载 体吸附剂 带在固相
基体上
高效微粒 具有不同 离子交换 孔径的多
剂 孔性凝胶
多种不同 性能的配 位体键联 在固相基 体上
流动相
不同极性 有机溶剂
不同极性 有机溶剂 和水
不同pH值 有机溶剂 不同pH值
的缓冲溶 或一定pH 的缓冲溶
第一节 高效液相色谱法基本原理
色谱分析法是分析化学中获得广泛应用 的一个重要分支，是一个具有强大生命 力的分离分析技术。
采用高压输液泵将规定的流动相泵入装 有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离 测定的色谱方法。注入的供试品由流动 相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离， 并依次进入检测器，由积分仪或数据处 理系统记录和处理色谱信号，最终得到 各组分的色谱峰。
（一）高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较 现代液相色谱法是在经典色谱理论 的基础上，采用了高压泵、化学键 合固定相高效分离柱、高灵敏专用 检测器等新实验技术建立的一种液 相色谱分析法。
二、与气相色谱法比较 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较
低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测
率最有影响的因素） HPLC：室温；高压
三、高效液相色谱法的特点
1 ．分离效能高 2 ．选择性高 3 ．检测灵敏度高 4 ．分析速度快
（二）高效液相色谱法的分类 及分离机制
※按固定相的聚集状态分类：
液液色谱法、液固色谱法
按分离机制分类： 分配色谱法、吸附色谱法、离子交 换色谱法、空间排阻色谱法及亲合 色谱法
第二节 高效液相色谱仪
1．贮液瓶（滤芯，可滤 去颗粒状物质）
2．高压泵（输液泵、梯 洗脱度）
3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
※（一）输液系统
一、储液装置：过滤器 二、脱气装置：脱气机 流动相脱气： （1）吹氦脱气法 （2）加热回流法 （3）抽真空脱气法