分枝杆菌菌种鉴定1 检测范围用于定性检测来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株样本中的核酸,检测指标包括临床常见分枝杆菌的17个种或群,包括:结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。

可用于结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病的辅助诊断,也可用于流行病学调查等领域。

2 方法原理基因芯片( genechip)也称为DNA芯片、DNA微陈列、寡核苷酸陈列,是指采用原位合成(或显微打印手段),将DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针陈列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。

基因芯片对分枝杆菌的菌种鉴定通过在芯片上设计种属特异性寡核苷酸探针,将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交反应,根据碱基互补配对原则,序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。

根据探针在芯片上的特定位置排布,就可以推断出相应被测细菌的相关信息,鉴定出被测细菌的种类采用基因芯片微量点样技术,将检测上述基因的特异探针与各种对照探针固定在基片上,检测探针和对照探针各重复5个点,形成12行×10列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列,每一个微阵列可以检测一份样品。

3 检测样本检测适用的标本类型为来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non- tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株。

存在于固体培养基上的待测分离株样本不可冷冻储存，因为冷冻会对后续操作造成影响；存在于液体培养基中的待测分离株样本在-70℃储存不超过5年。

用于培养的样本为取自患者的痰、脓液或分泌物、肺泡灌洗液、穿刺液（包括脑脊液、胸腹水、心包液、关节液、胆汁等）、尿液。

储存：待测分离株样本在2-8℃储存不超过2个月。

4 仪器设备PCR扩增仪、普通台式离心机、LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪、微阵列芯片杂交仪、芯片洗干仪、微型高速离心机、涡旋振荡器、水浴锅。

5试剂耗材5.1 试剂5.1.1芯片洗涤液：芯片洗涤液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2%。

依次将20×SSC、蒸馏水（或纯化水）、10% SDS按照10 : 88 : 2的比例混合，即为芯片洗涤液Ⅰ。

以配制总量600 ml为例：量取60 ml 的20×SSC及528 ml的蒸馏水（或纯化水）置于1 L的烧杯中，混匀。

再加入12 ml的10% SDS，混匀。

芯片洗涤液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。

将20×SSC、蒸馏水（或纯化水）按照1: 99的比例混合，即为芯片洗涤液Ⅱ。

以配制总量600 ml为例：量取6 ml 的20×SSC及594 ml的蒸馏水（或纯化水）置于1 L的烧杯中，混匀。

提示：若10% SDS产生白色絮状沉淀，请于50℃融化混匀后配制芯片洗涤液。

若芯片洗涤液Ⅰ产生白色絮状沉淀，请于50℃融化混匀，然后平衡至室温再使用。

5.1.2纯化水或者蒸馏水5.1.3 冰水混合物（取冰盒加水，冰冻2.5小时，因为扩增需要2.5个小时，所以在扩增开始时准备冰盒）5.1.4核酸提取液5.1.5P CR扩增试剂5.1.6杂交缓冲液5.2耗材5.2.1 HybSet基因微阵列芯片杂交盒5.2.2 微量移液器（规格：0.1-10 μl，2-20 μl，20-200 μl）5.2.3 移液器吸头（要求洁净无菌，规格：0.1-10 μl，2-20 μl，20-200 μl）5.2.4 离心管（要求洁净无菌，规格：200 μl，1.5 ml）5.2.5 八连排管（可选，要求洁净无菌，规格：200 μl）5.2.6 各种规格的离心管架6操作步骤6.1核酸提取6.1.1 准备工作取与标本数相同的1.5ml离心管，编号，取80µL核酸提取液于1.5ml离心管6.1.2分离菌株样本的采集从合适的固体培养基上用无菌的接种环挑取一个肉眼可见的菌落（若菌生长布满整个培养基，则挑取相应大小的菌苔）于含核酸提取液的核酸提取管中，即可进行后续的核酸提取。

尽量避免挑取固体培养基。

液体培养基（先混匀）内样本直接吸取等于或大于1个麦氏浊度的菌悬液10-20µL。

6.1.3核酸提取加入上述采集的分离株样本后，使用Extractor 36核酸快速提取仪振荡5分钟，95℃水浴30分钟，12000 rpm离心5分钟，此时得到的上清液就是核酸提取液，6.1.4取30µL于0.5ml离心管，瞬间离心10秒，此步骤使核酸提取液离到离心管底部，得到的核酸放置-20℃暂存（不超过2个月）。

6.2PCR扩增6.2.1配制PCR反应体系在PCR配液区内，根据被测样品数目准备200 μl八连排管，并预先标记样品编号。

从试剂盒中取出PCR扩增试剂使其充分融化（自然解冻），轻摇混匀后瞬时离心（离心机瞬离5秒）至管底。

6.2.2根据样品数目，将PCR扩增试剂按18 μl/管分装于200μl八连排管中，盖好管盖，然后将其转移至PCR扩增区。

在PCR扩增区内加入2 μl模板DNA。

模板DNA包括被测样品DNA（核酸提取管中的上清液）、阳性对照品或者阴性对照品。

此时得到的每份PCR反应体系总体积为20 μl。

建议：每次扩增时均使用阳性对照品和阴性对照品，其中阳性对照品可用于PCR扩增和杂交过程的质控。

阴性对照品可用于监测环境及操作过程中的污染情况6.2.3扩增将离心管或八连排管置于PCR扩增仪中，按（扩增程序选择：TB →MTB→DNA）加热循环程序进行PCR扩增反应。

同时准备冰盒（见4.1.3）6.2.4芯片的准备：在基因微阵列芯片杂交盒的底部加入200 μl蒸馏水（或纯化水，见图1），将托架放入盒体内的两个定位柱之间，将芯片正面向上，小心放在托架上，盖片四个凸台向下盖在芯片上（见图2）。

注意盖片的放置方向，其末端应与芯片末端的标签对齐。

图1：加200μl水湿润底部图2：放置芯片及盖片提示：1.操作应在较清洁的环境中进行，以避免灰尘落在芯片或盖片上，干扰结果判读。

2.不要用任何记号笔在芯片上做标记，否则可能造成芯片背景变脏，影响结果判读。

6.2.5杂交反应混合物的配制、变性及冰浴：1.根据样品数目准备200 μl八连排管并编号。

2.从试剂盒中取出杂交缓冲液，融化后充分混匀，在微量离心机中瞬时离心，按9 μl/管分装。

3. PCR扩增产物95℃加热变性5分钟（置于PCR仪中加热程序），放冰盒冰浴三分钟后，每管加入6 μl相应的PCR扩增产物此时杂交反应混合物为15μl6.2.6杂交反应：将杂交反应混合物从冰浴中取出，用微量移液器吹吸2次混匀，待白色絮状沉淀（如有）消失后，经盖片的加样孔加入13.5 μl 杂交反应混合物（见图4），迅速盖上杂交盒并密封（见图5）。

每个微阵列限加一份样品，记录芯片编号、微阵列位置及对应的样品编号。

立即将密封好的杂交盒水平放入50℃预热的恒温水浴锅中。

待杂交盒全部放入后计时120分钟。

图3：加入杂交反映物图4：杂交盒密封提示：加样过程中应避免加入气泡。

从加样开始至干燥芯片之前的任何一个环节中，均应避免芯片微阵列上的液体长时间直接暴露在空气中，以防干燥造成芯片背景高，干扰结果的判读。

6.2.7芯片洗涤液的准备：根据芯片数量配制芯片洗涤液Ⅰ和芯片洗涤液Ⅱ，体积以洗涤时能够完全浸没芯片为准。

混合均匀并平衡至室温（10-30℃）。

洗涤一次的量为：（洗液一：528ml蒸馏水+66ml20×ssc+12SDS=600ml）(洗液二：990ml水+10ml20×ssc=1000ml)6.2.8芯片的洗涤与干燥: 杂交反应结束后，用洗涤机器进行洗涤后，然后于离心机中800 rpm离心5分钟，甩干后扫描6.2.9芯片扫描和结果判读：使用LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪和相应软件进行信号的读取及结果判读。

操作简介如下（详见扫描仪及软件用户手册）：① 打开扫描仪和相应软件，点击“激光控制”按钮，预热10分钟。

②输入“样品编号”等样品相关信息。

③扫描仪预热完毕后，点击“出仓”按钮，将芯片平稳放置在托架小片上，④水平轻缓地推入扫描仪仓口，点击“入仓”按钮。

⑤输入芯片编号，点击选择检测区域（即微阵列1-4），点击“选择样品”为各微阵列选择相应样品。

点击“开始检测”按钮进行芯片扫描。

结果将在屏幕上显示并自动保存。

⑥一张芯片扫描完毕后重复进行下一张芯片的扫描直至全部扫描完。

⑦可通过“数据查询”页面进行数据查询及打印。

⑧ 完成全部操作后，关闭激光，退出软件，关闭扫描仪。

7 参考值（参考范围）：对于IC（分枝杆菌属）探针和结核分枝杆菌探针通过ROC方法确定其参考值。

对于其他16种非结核分枝杆菌检测探针均通过百分位数法确定其参考值。

当探针信号值大于或等于该探针的参考值，则该探针判读为阳性，当探针信号值小于该探针的参考值，则该探针判读为阴性。

试剂盒中各探针的参考值已经整合到相应判读软件中，由软件自动对样品检测结果进行判别。

8 检验结果的解释：8.1实验质量控制：本试剂盒阳性对照品的检测结果应为“结核分枝杆菌复合群”；阴性对照品的检测结果应为“无分枝杆菌”。

如果其中任何一个对照品结果错误，则同一次实验全部样品结果定为无效，需要进行复检。

8.2 结果判读方法说明：将探针信号值与参考值进行比较，如果探针信号值大于或等于该探针的参考值，则判读为阳性，否则判读为阴性。

然后对所有检测探针按信号值大小进行排序，获取信号值最大的探针8.3 异常结果处理：1）如果只有IC探针阳性，报告为“无法判读”，则需对样品进行复检。

2）如果复检仍为只有IC探针阳性，报告为“无法判读”，则表示该样品不在本试剂盒检测范围内9注意事项9.1操作注意安全防护。

操作致病菌DNA应在规定的实验场所进行，穿戴防护衣物、一次性手套、口罩；所有直接接触过细菌的物品应严格消毒后销毁或再次使用。

9.2本试剂盒对照品为质粒，可质控核酸扩增及杂交环节，不能质控细菌样品制备环节，建议用户自行准备结核菌进行样品制备环节的质控。

9.3有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室的管理规范执行。

PCR扩增应严格按照国家有关规定进行分区，以防止交叉污染。