０．１ＭＰａ灭菌２５ｍｉｎ￣３０ｍｉｎ，制成平板备用； 摇瓶培养基：按参考文献 ［２］方法配制。 麸曲培养基：按参考文献 ［２］方法，选取麦麸皮，水
洗后装入５００ｍＬ三角瓶中，０．１ＭＰａ 灭菌３０ｍｉｎ￣４５ｍｉｎ。 １．２ 方法 １．２．１ 测定方法
总糖和还原糖测定：按文献 ［３］的方法进行。 柠檬酸的酸度测定及转化率计算 ［３］：柠檬酸的酸度 测定是取发酵滤液１ｍＬ，酚酞为指示剂，０．１４２９ｍｏｌ／Ｌ￣ ０．１４３０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ滴定，所消耗ＮａＯＨ的毫升数即为酸 度产酸率。
Ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＭＡ Ｌｉ－ａｎ， ＨＥ Ｆｅｉ－ｙｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｃｈｉｎａ）
２００７ Ｎｏ．１１
·５８· Ｓ ｅｒｉａｌ Ｎｏ．１７６
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅ ｗｉｎｇ
Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅｓ
取分离样品１ｍＬ，接种于富集驯化培养基中，在３５℃、 ２００ ｒ／ｍｉｎ的摇床上培养４８ｈ，再取培养液１ｍＬ进行传代 驯化。每４８ｈ接种传代１次。经过若干代高温驯化后，选 择生长代谢旺盛、菌丝球丰富而小、分布均匀者供平板 分离初筛。 １．２．５ 平板分离初筛
将复筛得到的麸曲孢子分别接于摇瓶培养基中，以 原菌种作为对照（ＣＫ），每株３个重复，总糖０．１２ｋｇ／ｋｇ，在 ３５℃、２００ｒ／ｍｉｎ的摇床上培养７２ｈ，测酸度计算转化率。 ２ 结果与分析 ２．１ 初筛与复筛结果
经过高温驯化、平板分离初筛，共选出５５株菌接种 于斜面上，再经复筛得到耐高温且产酸率均高于对照 （ＣＫ）的８株柠檬酸菌进行发酵试验，结果见表１。
选取沙市柠檬酸厂夏季发酵良好的高温发酵液 ５００ ｍＬ作为分离样品；Ｃｏ８２７ 黑曲霉由上海微生物研 究所提供。 １．１．２ 培养基
富集驯化培养基：８°Ｂｘ￣１５°Ｂｘ麦芽汁１００ｍＬ，ｐＨ值自
然，０．１ＭＰａ灭菌２５ｍｉｎ￣３０ｍｉｎ； 分 离 培 养 基 ：５°Ｂｘ￣８°Ｂｘ 麦 芽 汁 １００ｍＬ，琼 脂 ２ｇ，
３ 结论 筛选出的耐高温柠檬酸菌株Ｔ５０和Ｔ５２号，在薯干醪
液中于３５℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养时产酸率和转化率均高于对 照黑曲霉Ｃｏ８２７，且转化率更接近理论转化值；同时发酵 周期缩短了２４ｈ，可减少柠檬酸通风搅拌发酵的费用。
参考文献：
［１］ 东玉武，孙建梅，王景明． 柠檬酸的应用与开发 ［Ｊ］． 天津化工， ２００３，１７（５）：３３－３４．
表１ 摇瓶发酵试验复筛结果 Ｔａｂｌｅ １． Ｓ ｅｃｏｎｄａｒｙ ｓ ｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂｙ ｓ ｈａｋｅ ｆｌａｓ ｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
表２ 复筛的黑曲霉麸曲孢子生长状态 Ｔａｂｌｅ ２． Ｇｒｏｗｔｈ ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓ ｐｏｒｅｓ ｏｎ ｂｒａｎ
［５］ 王电垒，马应伦，于瑞琪． 耐高温醋酸菌分离与筛选的试验研 究 ［Ｊ］． 中国酿造，１９９８（２）：１８－１９．
［２］ 马立安，贺飞英． 耐高酸柠檬酸高产菌种的驯化及筛选 ［Ｊ］． 湖 北农学院学报，２００２，２４（２）：１１７－１１８．
［３］ 王福源． 现代食品发酵技术 ［Ｍ］． 北京：中国轻工业出版社， １９９８：２２８－２３４．
［４］ 马立安． 耐高温酒精酵母菌驯化与筛选 ［Ｊ］． 湖北农学院学报， ２０００，２０（１）：７２－７３．
柠檬酸是一种用途广泛对环境没有任何破坏作用 的无色晶体，在食品和饮料工业中作为调味剂、保鲜剂、 防腐剂、抗氧化剂、增稠剂。柠檬酸深层通风发酵工艺 在夏季高温季节，要温度控制在３０℃￣３３℃，需采取一系 列降温措施，为减少降温所带来的麻烦和费用，采用耐 高温柠檬酸菌发酵是行之有效的措施之一。
以黑曲霉Ｃｏ８２７为出发菌种，从３３℃高温薯干醪柠 檬酸发酵液中分离菌种，经优筛得到２株耐高温、产酸 高、转化率高的优良菌株，为保障夏季柠檬酸生产的正 常进行提供了基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 样品
ｍｅｄｉｕｍ ｄｕｒｉｎｇ ｓ ｅｃｏｎｄａｒｙ ｓ ｃｒｅｅｎｉｎｇ
菌株号
Ｔ１ Ｔ１０ Ｔ２３ Ｔ３２ Ｔ４１ Ｔ５０ Ｔ５２ Ｔ５５ ＣＫ
麸曲孢子生长的状态
菌丝生长较快，孢子数量较多，颜色有点发黄 菌丝生长快，孢子黑，数量多 菌丝生长较快，孢子黑，数量较多 菌丝生长快，孢子黑，数量多 菌丝生长较快，孢子黑，数量较多 菌丝生长快，孢子黑，数量多 菌丝生长快，孢子黑，数量多 菌丝生长快，孢子数量多，但颜色微黄 菌丝生长较慢，孢子黑，但数量较少
表３ 摇瓶优选结果 Ｔａｂｌｅ ３． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓ ｕｌｔｓ ｂｙ ｓ ｈａｋｅ ｆｌａｓ ｋ ｓ ｃｒｅｅｎｉｎｇ
菌株号 产酸率／％ 转化率／％
Ｔ１０－１ １２．０ １００．３ Ｔ１０－２ １２．０ Ｔ１０－３ １２．１ Ｔ３２－１ １２．１ １００．６ Ｔ３２－２ １２．１ Ｔ３２－３ １２．０ Ｔ５０－１ １２．３ １０２．８ Ｔ５０－２ １２．３ Ｔ５０－３ １２．４
柠檬酸转化率＝（总酸／总糖）×１００％
１．２．２ 实验流程［４－５］
样品采集→富集驯化→平板初筛→斜面纯化→摇瓶复筛→ 麸曲孢子→摇瓶优筛→获得耐高温、产酸高的柠檬酸菌株
１．２．３ 柠檬酸菌种的耐温驯化［４－５］
收稿日期： ２００７－０５－２９ 基金项目： 长江大学科研发展基金（ＨＮＺＤ２００２１２） 作者简介： 马立安（１９６４－ ），女，湖北人，副教授，主要从事食品微生物、微生物分子生物学研究工作。
蘸取驯化柠檬酸菌液于分离平板上划线，３５℃培 养２４ｈ￣４８ｈ，挑选生长优良的单菌落接种于斜面试管中。 １．２．６ 摇瓶复筛
将初筛得到的菌株分别接种于摇瓶培养基中进行 摇瓶测酸，以原菌种作对照（ＣＫ），每株１瓶，总糖０．１３ｋｇ／ｋｇ， 在３５℃、２００ ｒ／ｍｉｎ的摇床上培养７２ｈ （还原糖≤０．５％）， 每２４ｈ测１次酸度，淘汰产酸较低的菌株，将产酸较高的 菌株接种于麸曲扩大培养基中，３５℃培养制成麸曲孢子。 １．２．７ 摇瓶优筛
经验交流
中国酿造
２００７ 年 第 １１ 期
总第 １７６ 期 ·５７·
耐高温柠檬酸菌种驯化及筛选
马立安， 贺飞英
（ 长江大学 生命科学学院， 湖北 荆州 ４３４０２５）
摘 要： 选取发酵良好的高温（３３℃）薯干醪柠檬酸发酵液，通过温度驯化与筛选，得到２株优良菌种，耐３５℃高温、发酵产酸性能优于 原柠檬酸菌种Ｃｏ８２７ 黑曲霉。 关 键 词： 柠檬酸黑曲霉；耐高温菌株；筛选 中图分类号： ＴＳ ２０１．３ 文献标识码： Ｂ 文章编号： ２０５４－ ０５７１（ ２００７） １１－ ００５７－ ０２
菌株号 产酸率／％ 转化率／％
Ｔ５２－１ １２．４ １０３．１
Ｔ５２－２ １２．４
Ｔ５２－３ １２．３
ＣＫ－１ １０．９
９０．３
ＣＫ－２ １０．８
ＣＫ－３ １０．８
菌株号
Ｔ１ Ｔ１０ Ｔ２３ Ｔ３２ Ｔ４１ Ｔ５０ Ｔ５２ Ｔ５５ ＣＫ
不同时间产酸率／％
２４ｈ
４８ｈ
７２ｈ
４．９
９．０
１１．３
４．８
８．８
１１．５
４．８
９．２
１１．３
５．１
９．３
１１．２
５．１
９．５
１１．３
Байду номын сангаас
５．１
９．９
１１．９
５．２
１０．０
１２．１
５．０
９．３
１１．８
４．６
８．９
１１．０
２．２ 优筛结果 Ｔ１０、Ｔ３２、Ｔ５０和Ｔ５２菌株的麸曲孢子在３５℃高温培
养条件下长势优于ＣＫ（表２）；在３５℃高温发酵７２ｈ产酸率 及转化率也均高于ＣＫ，但Ｔ５０和Ｔ５２的转化率更接近理 论转化率１０６％（表３），即Ｔ５０和Ｔ５２为所得２个优良菌株。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ－ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｒｏｔｈ ａｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ， ｔｗｏ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ ａｔ ３３℃ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ｂｏｔｈ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｇｒｏｗ ａｔ ３５℃ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｍｏｒｅ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｔｈａｎ ｔｈｅｉｒ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ Ａ． ｎｉｇｅｒ Ｃｏ８２７． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ； ｈｉｇｈ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ